论文部分内容阅读
猪PAM是PRRSV感染的靶细胞。为使抗PRRSV的外源基因在靶细胞中高效、特异性表达,培育出猪的抗PRRS转基因新品系,筛选猪PAM特异表达基因启动子是非常重要的。真核生物基因在无转录因子时,RNA聚合酶自身不能启动转录,故处于不表达状态,只有当转录因子(蛋白质)结合在其识别的DNA序列上后,基因才开始表达。因此,对特异表达基因启动子研究既包括启动子区顺式作用元件确定又包含转录因子调控作用。研究表明猪自然抗性相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)基因mRNA在单核巨噬细胞和肺、脾组织中都可表达,但在巨噬细胞中表达量最高。本研究通过半定量RT-PCR方法进行组织表达谱分析,验证了Nrampl基因为PAM特异表达基因。采用缺失表达载体,研究了Nrampl基因启动子在猪肺泡巨噬细胞、脂肪前体细胞、成纤维细胞和肾细胞的表达活性,获得具有特异性调控能力的核心启动子区。方法如下：1RACE技术确定Nramp1基因的转录起始位点Nramp1基因转录起始位点的确定为研究该基因的转录调控奠定了基础。通过NCBI下载Nramp1基因mRNA序列,并设计5’RACE特异性引物。依据Smarter RACEkit克隆出Nramp1基因5’非翻译区,确定其转录起始位点为A,位于ATG上游90bp处。GenBank登录号为HM754433.2Nrampl基因启动子缺失表达载体构建首先,利用生物信息学方法查找猪Nrampl基因5’调控序列,同时预测出启动子及转录因子结合位点大概位置；其次,应用PCR技术扩增不同长度缺失片段的启动子,分别连接到萤火虫荧光素酶报告基因pGL3-Basic载体上,经酶切、测序鉴定成功构建了八种重组表达载体pLUC1430、pLUC1136、pLUC840、pLUC751、pLUC487、 pLUC379、pLUC274、pLUC179。3缺失启动子活性分析及细胞特异性验证将萤火虫荧光素酶重组表达载体与海肾荧光素酶报告载体按照20：1共转染肺泡巨噬细胞,24小时后,通过双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性,以pRL-TK荧光活性值为内对照,并将pGL3-Basic(?)的基础活性值定为1,分析缺失启动子活性,筛选出核心启动子区为pLUC487。同时瞬时转染其他非巨噬细胞,如猪肾细胞、脂肪前体细胞、猪胎儿成纤维细胞。验证该核心启动子具有细胞特异性,同时筛选出与细胞特异表达相关的调控元件。通过生物信息学分析和实验研究相结合,筛选出Nrampl基因特异表达的核心启动子区pLUC487[-1327～+86],并初步确定Spl. AP-1、c-Ets、C/EBP、((?)R等转录因子具有特异性转录调控作用。可以利用Nrampl基因核心启动子及重要的转录调控元件在PAM中特异性地启动下游目的基因的表达。