分子影像和体外分子诊断是最有望实现肿瘤早期微、无创检测的两大技术。与经典影像不同,分子影像例如荧光分子成像,能够探查肿瘤早期形成过程中细胞和分子水平的异常,即在尚无解剖学改变之前就能检查出异常,这对肿瘤早期检测有重要价值。然而分子影像学技术的发展还处于临床前实验阶段,大多分子探针的靶向性或特异性还有待提高。另一方面,循环肿瘤DNA(ctDNA)因含有丰富的肿瘤相关遗传信息或突变信息成为体外分子诊断研究热点之一。借助PCR技术和DNA杂交技术,一些ctDNA检测试剂已经用于临床肿瘤疾病的辅助诊断。由于ctDNA在标本中的含量非常少,并且丰度较低的肿瘤突变基因中往往伴随着大量的野生型基因,这对ctDNA检测技术的灵敏度有很高的要求。现有的ctDNA检测技术的灵敏度有限,检测相应的低丰度突变(<1%)ctDNA的肿瘤标本时会出现漏检的情况。无论是分子影像还是体外分子诊断都需要发展高特异性、高灵敏度的分子探针。本研究聚焦于分子影像和体外分子诊断领域在临床应用中共同存在的问题并以此为出发点,探究提高DNA链置换探针特异性的方法及其用于改善分子影像技术和分子诊断技术性能的可行性,具体研究内容如下:第2章报道了一种基于DNA四面体(TDN)纳米结构和金纳米颗粒(Au-NPs)的高识别因子(DF)核酸纳米传感器,检测活细胞中的miRNA-21。链置换反应是指单链DNA侵入链与双链DNA探针上的立足点相结合,进而将探针的保护链从互补链上置换下来的过程。仅依靠沃森-克里克碱基配对的特异性来识别miRNA-21及其单碱基变异类似物是不够的。因此,本章专门设计了链置换探针立足点的部分碱基,控制链置换反应之前的吉布斯自由能和链置换反应之后的吉布斯自由能变化趋于零,在这一条件下,单碱基错配引起的微小能量差异就可以引起明显的杂交效率改变。利用Au-NPs装载特殊设计的分子探针,再用TDN协同运输分子探针,构建了基于荧光共振能量转移的纳米传感器(Au-TDNNs),用于活细胞内miRNA-21的快速检测。合理设计的TDN序列与探针序列之间互不干扰,因此可以实现传感器的简便、快速组装。该方法获得了较好的分析性能:通过测试单碱基改变的miRNA-21类似物,let-7d和miRNA-200b,特殊设计的分子探针在近端单碱基错配的DF为15.4。作为对照组,普通分子探针的DF仅达到2.4。使用肝癌细胞(HepG2)进一步证实了该传感策略的可行性。AuNPs和TDN的协同运输使细胞内最佳成像时间提前至1个半小时。因此,该研究为细胞内小分子快速、特异性原位成像提供了一种有效的方法。现有的一些检测方法灵敏度较低会造成对低丰度突变样本的漏检,这是肿瘤基因突变检测面临的最大问题之一。因此,建立高特异性、高灵敏度的突变基因检测方法十分重要。第3章使用Bulge-loop(BL)结构调节DNA链置换探针的特异性,获得了用于肿瘤相关突变基因检测的高特异性探针。在上一章中,通过调整链置换探针立足点部分的碱基组成从而最大限度地使链置换反应前后的能量产生和消耗趋于平衡,提高了链置换探针的特异性。但由于立足点碱基序列的变化程度有限,调节链置换探针反应的热力学平衡来提高探针特异性仍然是一个挑战。在本章中,通过将BL结构引入链置换探针来调节对SNV的识别能力。基于BL对反应自由能变化(ΔG)的可控调节,BL探针(BLP)获得比常规线性链置换探针高得多的特异性。为了降低野生型基因对点突变检测造成的影响,实验同步设计了竞争性阴影探针来封闭野生型基因。动力学检测结果证实,探针对L858R突变的检测限可以达到0.02%。通过BL结构的引入,本研究获得了更高特异性的链置换探针。第4章基于BLP建立核酸传感器,用于检测肿瘤样本中的低丰度点突变。许多分子检测方法在检测人工合成的DNA样本时性能良好,但在检测肿瘤临床样本时却无法直接使用。因为临床样本中突变基因的含量非常少,同时野生型基因会对检测结果造成干扰。另一方面,人工合成DNA片段为单链DNA,而在临床样本中多为双链DNA,没有杂交活性。因此,本章将重点解决点突变基因的扩增和单链靶基因的获取问题。PCR是分子诊断的最重要的扩增技术,不对称PCR可以直接扩增模板DNA并获得单链产物。然而,用5’磷酸基团修饰引物,再用λ核酸外切酶水解PCR产物同样可以获得单链靶标。为了找到更有效的扩增方法,联合BLP对比了这两种PCR技术的效果,发现λ核酸外切酶水解PCR产物的方法更有利于低丰度点突变的检测,这里简称酶切法。为了研究BLP检测血清中ctDNA的能力,使用标准添加法在10%的血清中配制一系列不同丰度的L858R突变样本。利用BLP联合酶切法检测血清样本,获得了0.1%的检测限。更重要的是BLP正确识别了商业PCR试剂盒或sanger测序无法检测到的低丰度L858R突变肺癌样本。该检测结果与液滴数字PCR检测结果对比具有高度的一致性。本研究为建立高灵敏分子诊断技术提供了新的方法。