研究背景维生素B6(VitB6)包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺以及各自的磷酸盐形式,其中磷酸吡哆醛(PLP)是VitB6在体内存在的生物活性形式,作为多种关键酶的辅因子参与多种代谢过程。在氨基酸代谢、糖异生、鸟氨酸循环、血红素合成等过程中起重要作用。大量临床研究发现外源性补充VitB6可以明显降低危重病人、风湿性关节炎、阿尔茨海默病、帕金森病等患者体内的炎症和氧化水平。当VitB6缺乏或耗尽时,导致低色素小细胞性贫血和亚铁离子升高,血红素合成被阻断。近年来越来越多的证据表明,VitB6 可以防止过氧化氢诱导的脂质过氧化和氧自由基的产生。此外,VitB6作为辅酶通过调节同型半胱氨酸(HCY)代谢,在防止HCY引起的氧化应激中发挥重要作用。脓毒血症是全身性炎症反应主要由感染导致,可引起体内多器官功能障碍或衰竭尤其是心功能紊乱。机体感染外源性细菌、病毒或真菌后,免疫系统产生一系列级联反应,可引起心肌抑制和功能紊乱。在重症监护病房中,严重的全身性败血症和感染性休克是患者主要的死亡原因。虽然作用机制不同的多种广谱抗生素已经广泛应用于临床,但败血症仍然是一个难以克服的问题。脓毒血症诱导的炎性细胞因子的过量产生可导致患者出现心力衰竭,同时败血症诱导产生的过量自由基也会引起心肌损伤。在脓毒血症诱导的心肌病中可以发现心肌组织结构发生明显损伤。临床研究发现脓毒血症患者体内高水平的炎症因子和过量氧自由基可引起左心室功能紊乱,进而导致心衰。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要生物活性成分,是启动炎症级联反应的关键,可以模拟临床脓毒血症。LPS诱导心肌损伤的机制有多种,其中自氧化诱导的过量自由基的产生被广泛接受。大量研究表明,在LPS诱导的小鼠脓毒血症模型中,由于钙超载、过量自由基以及缺氧导致心肌细胞在结构和功能上具有明显的抑制作用。因此,LPS诱导的脓毒血症可引起严重的心肌损伤。许多研究已经证实LPS在体内可以诱导细胞死亡,多种机制参与调节细胞的死亡,例如我们很熟悉的细胞凋亡,坏死以及自噬。LPS是否可以诱导铁死亡还不是很明确,铁死亡是一种新型的细胞死亡方式,在遗传学、生物化学、形态学等方面不同于凋亡、坏死和自噬,具有其独特的表现形式。该类型细胞死亡的特点是细胞内活性氧(ROS)和脂质过氧化产物例如丙二醛(MDA)、4-羟基壬烯醛(4-HNE)的积累引起的细胞死亡,该过程是铁依赖的。目前铁死亡的机制主要与GPX4的活性以及细胞内铁水平相关。铁死亡可由多种因素通过抑制谷胱甘肽(GSH)的合成或抑制谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的生物活性引起,当体内GSH水平下降或耗竭时或GPX4活性被抑制时可诱导细胞发生铁死亡。研究发现铁死亡可以被铁螯合剂所抑制,表明铁死亡是铁依赖的过程。大量研究表明,铁死亡与多种疾病有关,如缺血再灌注(I/R)引起的心肌病、脂肪性肝炎、肾脏变性和神经退行性疾病以及各种癌症,这些疾病均和炎症相关,但是目前铁死亡与炎症之间的关系还不是特别清楚。因此,抑制或增强铁死亡作用将成为相关人类疾病的新策略。凋亡是细胞程序性死亡的一种形式,可由生理和病理刺激引起。在固有的凋亡通路中,各种刺激导致了Bcl2家族促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的失衡。然而,外源性途径与激活半胱天冬酶(caspase)有关。大量研究表明,细胞凋亡异常与多种疾病相关例如癌症、自身免疫性疾病、老年痴呆等。体内感染可以诱导感染性心肌病,严重性感染例如脓毒血症可以导致全身性炎症、氧化应激和细胞凋亡。因此抑制炎症反应、氧化应激和细胞凋亡等可以发挥保护心肌病的作用。研究已经证实LPS可以通过诱导机体产生大量促炎因子、氧化应激和细胞凋亡进而导致严重的心肌损伤。核转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)在人类基因组中负责调节数百种抗氧化相关基因。这些基因激活后与抗炎、抗氧化及抗凋亡密切相关,许多学者已经证实,通过抑制NF-KB信号通路进而上调Nrf2的表达发挥抗凋亡的作用。Nrf2通过调节下游抗氧化酶的表达与铁死亡密切相关,就铁死亡的内源性机制而言,Nrf2是调节铁死亡发生和结束的关键因子。Sasaki等人发现与铁死亡相关的几乎所有基因均由Nrf2转录调控,例如GSH、GPX4的合成及铁调节相关过程(包括铁转入细胞、转出细胞、血红素合成和分解代谢)等。Nrf2的激活对细胞的氧化还原状态的改变很是敏感,因此铁死亡相关的脂质过氧化可以激活Nrf2基因。上述表明Nrf2与凋亡和铁死亡密切相关。许多研究已经证实体内由各组因素诱导产生的自由基,可以导致细胞膜破裂以及脂质膜发生过氧化。MDA是体内多种不饱和脂肪酸的代谢最终产物,在实验研究中常被用来作为脂质过氧化的指标。GSH和超氧化物歧化酶(SOD)是体内重要的抗氧化剂。GSH由3种氨基酸羧合而成,具有显著的抗氧化作用,在GPX4的催化下清除体内有毒过氧化物和多余的自由基。SOD作为一种酶在体内具有多种生理活性,通过抗氧化和抗炎作用发挥其保护作用。因此以上指标可用于检测体内氧化应激和脂质过氧化水平,而氧化应激和脂质过氧化与铁死亡和凋亡密切相关。心肌肌钙蛋白(cTnl)和乳酸脱氢酶(LDH)分别是心肌细胞损伤时释放至血液中的蛋白和特异性心肌酶,因此cTnl和LDH常被作为心肌损伤的证据。我们课题组已经证实VitB6在小鼠体内可以抑制LPS诱导炎症,因此在本研究中,我们主要研究了VitB6在LPS诱导的心肌损伤中的作用,VitB6通过抑制氧化应激进而激活Nrf2转录因子发挥抑制铁死亡和细胞凋亡保护心肌免受LPS诱导的损伤的作用。研究目的1.探究VitB6对LPS诱导的心肌损伤的保护作用。2.探究VitB6是否通过激活Nrf2蛋白抑制铁死亡和凋亡发挥保护心肌的作用研究方法1.构建小鼠心肌损伤模型和分组将27只12周龄的C57BL/6J雄性小鼠(体重25±2g)随机分别分为3组(每组9只):对照组(control)、脂多糖组(LPS)、维生素B6+脂多糖组(VitB6+LPS)。脂多糖组和维生素B6+脂多糖组的C57BL/6J小鼠腹腔注射生理盐水或者VitB6(20mg/kg),6小时后腹腔注射脂多糖4mg/kg,对照组注射生理盐水,24小时后对小鼠行安乐死,并且留取血清、心脏、肝脏等组织标本。2.心功能评估小鼠行安乐死前进行心脏超声检查,首先将小鼠吸入异氟醚进行挥发性麻醉,再用脱毛膏去除胸毛,将小鼠固定在加温的成像平台上,并涂抹耦合剂。Vevo2100成像系统配备一个40兆赫高频传感器(VisualSonics公司,加拿大多伦多)被应用于无创检查。采用胸骨旁长轴M型超声心动图测量左室射血分数(EF)、缩短分数(FS)及左室收缩和舒张末容积。3.小鼠生存测定用生理盐水或VitB6(20mg/kg/day)腹腔注射预处理小鼠7天,然后用LPS(20mg/kg)腹腔注射小鼠,每天监测3次小鼠死亡情况,连续7天。选用DMSO、tween 80、NMP、PEG400等不同比例组成的溶剂,用于溶解ferrostatin-1(Fer-1)和 emricasan,经腹腔注射给药 Fer-l(2mg/kg)、emricasan(2.5mg/kg)或 DMSO,24h后给予腹腔注射LPS(20mg/kg),每天监测3次小鼠死亡情况,连续监测7天。4.检测肌钙蛋白I(cTnl)、乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)采用不同试剂盒检测血清中cTnI、LDH、MDA、SOD水平及心肌组织中MDA、SOD的浓度。流式细胞术检测总ROS和脂质ROS。5.心肌组织学分析心肌组织石蜡切片脱蜡水化,经苏木精和伊红染色(H&E)进行组织形态学分析,并在显微镜下拍照(尼康,东京,日本)。6.细胞培养及处理胚胎大鼠心脏来源的H9C2细胞系从美国模式培养物集存库(ATCC)中获得,H9C2细胞使用前先用全反式维甲酸(RA,lOnM)进行分化处理形成心肌细胞,于1%胎牛血清中培养5天。分化后的心肌细胞保存在DMEM中,含有4.5g/L的d-葡萄糖,并添加10%胎牛血清和青霉素-链霉素。VitB6(500μM)预处理心肌细胞2小时,然后给予LPS(l00ng/ml)刺激24小时。所有细胞在37℃,95%空气和5%C02的潮湿环境中培养。7.蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)提取各组小鼠心肌组织或心肌细胞蛋白裂解液,通过Western Blot法检测蛋白质:Bc12、Bax、C-caspase3、GPX4、NQO1、Nrf2、HO1、Transferrin receptor、FPN1和Ferritin蛋白及内参Gadph、β-actin蛋白的表达量。8.实时定量PCR提取小鼠心肌组织总RNA,检测总RNA浓度,严格按照逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA,使用SYBR Green定量检测心肌组织中Nrf2的mRNA水平的表达量。9.电镜观察线粒体结构VitB6预处理分化处理过的H9C2细胞2小时,然后给予LPS(100ng/ml)刺激24小时,弃掉培养基,不清洗细胞,加入电镜固定液,然后刮取细胞,离心收集细胞,弃掉固定液,加入新的电镜固定液,室温固定2小时后转移至4℃保存运输至电镜拍摄公司进行后续涂片、染色、拍照等。10.流式细胞术检测处理过的细胞,按照1:1000的比例用无血清培养基稀释DCFH-DA,使其终浓度为10μM,每孔加入1ml稀释后的探针,37℃,孵育30分钟,用无血清培养基冲洗细胞3次,刮取细胞,离心收集至流式管中,每管加入500μl的PBS,上机检测,选择FITC通道检测。研究结果1.VitB6 可改善LPS诱导的心肌损伤已有研究表明,VitB6 可改善心肌缺血发挥保护心功能作用。为了研究VitB6对LPS诱导的心肌损伤的保护作用,VitB6(20mg/kg)预处理小鼠6小时,然后腹腔注射LPS(4mg/kg)刺激24小时。LPS组与对照组相比,射血分数(EF)和缩短分数(FS)明显降低,左室收缩末容积增加;而VitB6+LPS组与LPS组相比,心功能明显改善。生化检测发现LPS刺激后小鼠血清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)和乳酸脱氢酶(LDH)显著升高;而VitB6+LPS组小鼠血清cTnI和LDH较LPS组明显降低。心肌组织H&E染色,显示对照组肌原纤维结构正常,LPS组心肌组织出现明显肿胀和断裂,而VitB6+LPS组轻度肿胀。2.在血清和心肌组织中,VitB6可降低LPS诱导的氧化应激和脂质过氧化丙二醛(MDA)是膜脂质过氧化最重要的产物之一,超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶,能清除自由基。谷胱甘肽(GSH)是由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸组成的三肽,是一种重要的抗氧化剂,可以保护血红蛋白不被氧化。LPS刺激后小鼠血清和心肌组织中MDA水平明显升高,而VitB6+LPS组MDA水平显著降低。在LPS组小鼠体内,SOD活性和GSH水平明显降低,而在VitB6+LPS组SOD活性和GSH水平显著增加。Nrf2是抗氧化反应中重要转录激活因子,激活后通过促进下游抗氧化酶的表达发挥抗氧化作用。为了确定VitB6是否可以激活心肌组织中Nrf2的表达,我们通过Western Blot和实时定量PCR检测小鼠心肌组织Nrf2的表达水平。结果表明VitB6可促进心肌组织中Nrf2的表达。这些结果表明,VitB6通过激活Nrf2抑制LPS引起的氧化应激和过氧化反应。3.在心肌细胞中,VitB6改善LPS诱导的氧化应激和脂质过氧化为了进一步探究VitB6在细胞中是否可以改善LPS诱导的氧化应激和脂质过氧化,我们对细胞中SOD活性、ROS和脂质过氧化水平进行了检测。VitB6预处理细胞2小时,然后给予LPS刺激24小时。在LPS组细胞中,MDA、总ROS以及脂质ROS的水平增加,SOD活性下降。然而在VitB6+LPS组细胞中,MDA和ROS水平降低,SOD活性增加。表明VitB6在体外实验中依然可以抑制LPS诱导的氧化应激和脂质过氧化,该结果与体内实验结果一致。4.VitB6调节Nrf2蛋白和相关抗氧化酶的表达氧化应激产生的ROS可作用于下游的Nrf2和相关抗氧化酶,大量研究表明,GPX4失活可触发铁死亡,而在许多疾病中上调Nrf2信号可抑制铁死亡。NQO1和HO1是重要的抗氧化酶,在Nrf2信号通路中起重要作用。为了阐明VitB6对这些蛋白的影响,在本研究中,VitB6预处理心肌细胞2小时,然后给予LPS刺激24小时,Western Blot检测相关蛋白表达水平。LPS降低Nrf2、HO1、GPX4和NQ01的表达。VitB6显著增加了上述蛋白的表达。这些结果表明,VitB6可能通过激活Nrf2和增加相关抗氧化酶的活性抑制LPS诱导的铁死亡。5.VitB6可降低LPS诱导的非血红素铁和血红素水平的增加体外实验中我们已经证实LPS降低GPX4的活性,而GPX4失活是启动铁死亡的关键。铁死亡的特征是一种铁依赖性的细胞内活性氧(ROS)和脂质过氧化产物的积累导致的细胞死亡方式。为了探究LPS和VitB6对非血红素铁和血红素的影响,我们检测了小鼠血清和心肌组织中的铁和血红素。发现与对照组相比,LPS组小鼠血清和心脏组织中的铁和血红素水平明显升高,而VitB6+LPS组改降低非血红素铁和血红素水平。提示VitB6可能通过降低细胞中铁水平抑制铁死亡。6.在心肌细胞中,VitB6调节铁调节相关蛋白的表达。体内铁水-平异常与许多疾病密切相关,细胞内铁稳态的维持需要多种蛋白的参与。转铁蛋白将铁转运至细胞膜上与转铁蛋白受体结合将铁转至细胞内,而铁转运蛋白(FPN1)将铁转运至细胞外,调节细胞内铁的水平。铁蛋白,一种铁结合蛋白,主要是储存铁,可以感受铁水平的变化进而调节细胞内铁水平。本研究探究了VitB6和LPS对铁调节相关蛋白转铁蛋白受体、FPN1和铁蛋白的影响。细胞经PBS或VitB6预处理2小时后,给予LPS刺激24小时,Western Blot检测铁调节相关蛋白表达量的变化。LPS处理后转铁蛋白受体和铁蛋白表达量明显增加,而膜铁转运蛋白表达降低。VitB6+LPS组较LPS组细胞转铁蛋白受体和铁蛋白表达水平降低而膜铁转运蛋白表达增加。7.VitB6可减轻LPS诱导的心肌组织凋亡有研究报道,VitB6可保护肠上皮细胞免受电离辐射诱导的凋亡。为了研究VitB6是否能抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡,我们采用TUNEL和Western Blot方法检测了VitB6对LPS诱导的细胞凋亡的影响。LPS刺激后TUNEL阳性细胞数量明显增加,而在VitB6+LPS组小鼠心肌组织中,阳性细胞数量明显减少。Western blot检测凋亡相关蛋白,LPS增加了心肌组织促凋亡蛋白Bax的表达,降低了抗凋亡蛋白Bc12的表达,而VitB6则逆转了Bax/Bcl2的表达水平。以上结果表明,VitB6抑制LPS诱导的心肌组织凋亡。8.在心肌细胞中,VitB6可降低LPS诱导的细胞凋亡将细胞种在96孔板中,VitB6(500μm)或PBS预处理2小时,然后给予不同浓度的LPS刺激24小时。细胞活力测定采用细胞计数试剂盒8(CCK8),VitB6明显降低LPS(100ng/mg和1000 ng/ml)诱导的细胞死亡。为进一步证明VitB6抑制细胞凋亡,用VitB6(500μm)对H92C2细胞预处理2 h,然后用LPS(1O0ng/ml)刺激24h。用TUNEL试剂盒检测VitB6对LPS诱导的细胞死亡的影响。LPS组TUNEL 阳性细胞明显增多,而VitB6+LPS组TUNEL阳性细胞数量明显减少。Western Blot检测凋亡相关蛋白,cleaved caspase3、Bax表达水平升高,Bc12表达水平降低。上述结果表明VitB6可以抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡。9.在心肌细胞中,VitB6改善LPS诱导的线粒体损伤当发生细胞凋亡时,细胞线粒体明显肿胀,线粒体嵴断裂甚至空泡化。我们在电镜下观察细胞内线粒体结构,对照组H9C2细胞线粒体膜基本完整,线粒体嵴清晰。LPS刺激后线粒体肿胀,线粒体嵴断裂甚至消失。VitB6+LPS组细胞内线粒体仍然有肿胀,但线粒体嵴清晰完整。表明VitB6明显改善了 LPS诱导的线粒体损伤。10.Fer-1和Emricasan模拟了 VitB6的药理学效应,降低LPS诱导的小鼠死亡率为进一步研究VitB6对LPS小鼠的保护作用,用VitB6(20mg/kg/day)对小鼠预处理7天,然后腹腔注射LPS(20mg/kg),每天监测3次小鼠死亡情况,持续7天。VitB6+LPS组的小鼠的存活率高于LPS组。我们猜想LPS可能会引起铁死亡和细胞凋亡,为进一步证实这一假设,我们采用Fer-1(2mg/kg),铁死亡抑制剂和Emricasan(2.5mg/kg),凋亡抑制剂,模拟VitB6的药理学效应,预处理小鼠24小时,然后给予LPS(20mg/kg),每天监测3次,连续7天。经Fer-1和Emricasan预处理的小鼠的生存率明显高于LPS组,该效应与VitB6相似。11.实验结论1.VitB6可改善LPS诱导的心肌损伤。2.VitB6通过增加Nrf2蛋白的表达及相关抗氧化酶的活性抑制LPS诱导的铁死亡和细胞凋亡发挥保护心肌的作用。研究背景炎症性疾病大多是炎症失控导致的结果,从而引起正常组织结构的损伤和破坏。肺炎是一种主要由病原体、免疫损伤及吸入性理化因子等引起的终末气道、肺泡及其间质等下呼吸道炎症性疾病,临床肺炎患者主要由病原微生物引起,例如革兰阴性杆菌、肺炎链球菌等。脂多糖(LPS)作为一种内毒素,是革兰阴性杆菌细胞壁的主要活性成分,是引起炎症反应的关键物质。因此阐明炎症潜在的发生机制,对于开发治疗肺炎的有效新策略具有重要意义。包括巨噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞等在内的多种免疫细胞在肺炎的发生发展过程中发挥重要作用。例如,致病因子激活巨噬细胞后释放多种炎症因子如活性氧、多种蛋白水解酶以及细胞因子包括白介素-1β(IL-Iβ)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等,这些炎症因子进一步导致严重的炎症损害。因此,抑制巨噬细胞的活化被认为是治疗脂多糖诱导的肺部炎症的重要策略。维生素B6(VitB6)是一种水溶性维生素,主要包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺及其相应的磷酸盐形式。VitB6在体内作为多种关键酶的辅酶因子参与多种代谢相关活动,包括氨基酸、脂肪、鸟氨酸循环、血红素合成和糖异生代谢活动等。5’-磷酸吡哆醛(PLP)作为VitB6在体内发挥作用的活性形式,可以反映长期VitB6在体内的储存情况。目前研究表明血浆PLP浓度降低与心血管疾病风险增加密切相关;Huang SC等人的临床研究发现对风湿性关节炎患者给予外源性补充VitB6可以降低患者血浆中炎症因子IL-6和TNF-α的水平;另外,已有研究表明VitB6可以抑制LPS诱导IL-1β的产生。在上述研究中VitB6通过抑制炎症反应对机体发挥保护作用。目前大量临床研究发现VitB6通过抗氧化应激可以缓解阿尔茨海默病和帕金森疾病的临床症状。然而,VitB6是否对肺部炎症产生有效影响仍然不清楚。腺苷5’-磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK),一种由α,β和γ亚基组成的异源三聚体,其中α亚基为催化亚基,β和γ亚基为调节亚基。AMPK是细胞内的一种能量感受器,当一磷酸腺苷(AMP)与三磷酸腺苷(ATP)的比例增加时例如低氧、运动等均可以激活AMPK。AMPK是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,作为能量感受器在生物能量代谢调节中发挥关键作用。许多研究表明AMPK通过磷酸化下游靶点,进而在肥胖、代谢综合征、二型糖尿病等许多疾病中发挥重要调节作用。我们课题组的研究结果表明AMPK激活后通过抑制氧化应激在心血管疾病中发挥多种保护作用。肥胖、代谢综合征、糖尿病等均与炎症相关,有研究发现AMPK的抗炎机制主要通过抑制NF-KB信号通路发挥抗炎作用。DOK1(The Downstream of Kinase 1)配体蛋白家族与DOK3蛋白主要存在于免疫细胞中它们之间的关系非常密切,相互之间存在一定的功能冗余。研究发现缺乏DOK1至DOK3蛋白的小鼠发生肺癌和组织细胞性肉瘤表明DOK蛋白家族在调节体内细胞反应中发挥重要的功能性作用。DOK1和DOK2蛋白在LPS诱导巨噬细胞产生TNF-α的过程中发挥负性调节。Humphrey MB等人认为在巨噬细胞中,DOK3蛋白与LPS刺激后激活的Toll样受体(TLR)信号通路相关,并且负性调节LPS反应和内毒素耐受。Lam KP等人发现DOK3蛋白调节TLR信号通路的机制是通过DOK3蛋白的降解或者酪氨酸的磷酸化。有研究表明,机体感染真菌时,DOK3蛋白酪氨酸磷酸化,DOK3-PP1蛋白与Card9解离,Card9蛋白磷酸化进而激活NF-KB信号通路促进炎症反应。通过上述研究猜测,VitB6可能通过激活AMPK,抑制DOK3蛋白的酪氨酸磷酸化发挥抗炎作用,预防LPS诱导的急性肺损伤。目前,AMPK蛋白、DOK3蛋白和LPS诱导的急性肺损伤之间的的关系尚未阐明。本研究的目的在于探讨VitB6在急性肺损伤中的作用及其分子机制。我们的研究数据表明,VitB6通过激活AMPK蛋白抑制LPS诱导的DOK3蛋白的酪氨酸磷酸化抑制炎症反应,从而保护肺组织免受损伤。研究目的1.在体外实验中,提取小鼠腹腔巨噬细胞,探究VitB6对AMPKα2蛋白的影响。2.在体外实验中,提取小鼠腹腔巨噬细胞,探究VitB6对LPS诱导的炎症因子蛋白及基因水平表达的影响。3.在体内实验中,构建小鼠急性肺损伤模型,检测小鼠肺组织及全身炎症水平。4.在体外实验中,提取小鼠腹腔巨噬细胞,通过构建并转染AMPKα2基因干扰,探究AMPKα2基因在LPS诱导的炎症过程中的作用。5.在体内外实验中,探究DOK3基因在VitB6抑制LPS诱导的肺部炎症中的作用。研究方法1.小鼠急性肺损伤模型的建立和分组:分别将45只小鼠8-12周龄的B129及DOK3-/-雄性小鼠(体重25±2g)随机分别分为3组(每组15只):对照组(control)、脂多糖组(LPS)、维生素B6+脂多糖组(VitB6+LPS)。脂多糖组和维生素B6+脂多糖组的B129及DOK3-/-小鼠腹腔注射生理盐水或者VitB6(20mg/kg),6小时后腹腔注射脂多糖或者生理盐水500μg/kg,24小时后对小鼠行安乐死,并且留取血清、肺、心脏、肝脏等组织标本。2.肺组织免疫组化染色小鼠肺组织于4%多聚甲醛中固定过夜,流水冲洗肺组织12-16小时,组织程序化脱水至蜡,包埋肺组织制作石蜡切片(每张切片厚度:5μm),然后进行接下来的实验。石蜡切片脱蜡至水,苏木精-伊红(H&E)染色,用于观察肺组织形态,肺泡细胞大小及其排列。通过免疫组化检测小鼠肺组织中IL-lβ、TNF-α及IL-6三种炎症因子的表达量。3.小鼠腹腔巨噬细胞的提取8-12周雄性小鼠腹腔注射1毫升高压灭菌后的6%可溶性淀粉,72小时后脱臼处死处理过的小鼠,75%乙醇中消毒5分钟。将小鼠固定与消毒灭菌后的泡沫板上,使用消毒过的剪刀、镊子将小鼠腹部皮肤剪开,同时将腹膜剪开约1厘米,用无菌滴管将预冷的3毫升无菌PBS注入腹腔反复冲洗3次回收冲洗液于离心管中,如是重复数次至冲洗液澄清。1000 rpm/min离心冲洗液,弃上清。用含10%胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的低糖DMEM培养基重悬细胞,并将细胞直接接种入12或6孔板中。4.细胞培养及处理提取的原代腹腔巨噬细胞,用含10%胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的低糖DMEM培养基培养,均匀种在12或6孔板中,放于37℃、5%CO2的细胞培养箱中。为了研究VitB6对AMPK的影响,将维生素B6予以不同浓度梯度(0、1、10、100、1000μM)及不同时间梯度(0、5、15、30、60、120 min)处理;将VitB6与compound C同时处理原代细胞后AMPK的变化。为研究VitB6对脂多糖诱导的炎症的影响,使用不同浓度(0、1、10、100、1000μM)VitB6预处理巨噬细胞2小时后给予脂多糖100(ng/ml)刺激24小时,收取细胞及其上清。5.蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)提取小鼠肺组织以及腹腔巨噬细胞总蛋白,采用Western Blot方法检测蛋白质:pAMPK、AMPK、DOK3及β-actin蛋白的表达量。6.酶联免疫吸附试验(ELISA)收集培养的细胞上清及小鼠血清置于-80℃冰箱保存,时间不宜过长。严格按照ELISA试剂盒说明书检测上清及血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的浓度。7.实时定量PCR提取原代腹腔巨噬细胞总RNA,检测总RNA浓度,严格按照逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA,使用SYBR Green定量检测IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA水平的表达量。8.巨噬细胞转染AMPKα2小干扰原代巨噬细胞种板,细胞密度80%左右,使用opti-MEM和RNAimax试剂转染小干扰,37℃、5%CO2孵育24小时后换液,更换培养基8-12小时后给予其他处理。9.DOK3过表达腺病毒转染DOK3-/-小鼠腹腔巨噬细胞提取、种板,细胞密度80%左右,普通培养基转染DOK3过表达腺病毒,37℃C、5%CO2孵育24小时后换液,更换培养基8-12小时后给予其他处理。研究结果1.巨噬细胞中VitB6磷酸化AMPK提取腹腔巨噬细胞种板,给予不同浓度的VitB6刺激2小时以及1mM的VitB6刺激不同时间,VitB6刺激30 min时磷酸化AMPK表达量明显增加。VitB6和compound C同时处理巨噬细胞,VitB6诱导的AMPK磷酸化可以被compound C 逆转。2.VitB6抑制DOK3蛋白的磷酸化VitB6刺激野生型原代腹腔巨噬细胞2小时后予以LPS处理24小时,LPS组磷酸化DOK3蛋白与control组相比明显增加,VitB6组磷酸化DOK3蛋白与control组相比增加不明显,VitB6+LPS组磷酸化DOK3蛋白与LPS组相比增加不明显。3.VitB6抑制LPS诱导的炎症因子的表达VitB6预处理野生型原代腹腔巨噬细胞2小时后予以LPS处理24小时,收取细胞提取总mRNA检测炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA及蛋白水平的表达量。与对照组相比LPS刺激后炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA及蛋白水平的表达量明显增加,但VitB6预处理2小时后给予LPS刺激,与LPS组相比炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA及蛋白水平的表达量明显降低。4.AICAR通过DOK3蛋白抑制LPS诱导的炎症因子的表达在体外实验中,AICAR预处理野生型原代巨噬细胞30分钟后给予LPS刺激24小时,收取细胞提取总mRNA检测炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表达水平。与对照组相比LPS刺激后炎症因子表达水平明显升高,与LPS组相比,AICAR预处理后细胞炎症因子表达量明显降低。在DOK3-/-小鼠原代腹腔巨噬细胞中,AICAR及LPS处理DOK3-/-小鼠原代腹腔巨噬细胞,收取细胞提取总mRNA检测炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表达水平,在DOK3-/-小鼠原代腹腔巨噬细胞中,AICAR5.VitB6通过AMPK发挥抗炎作用在体外实验中,对野生型巨噬细胞转染AMPK小干扰RNA或阴性对照小干扰RNA,转染24小时后,换液,予以VitB6及LPS处理,提取细胞总mRNA检测炎症因子的表达水平。在阴性对照组中,LPS刺激后炎症因子表达明显增加,与LPS刺激相比,VitB6及LPS处理后细胞炎症因子表达明显下降。然而,在转染AMPK小干扰RNA组中,LPS刺激后炎症因子表达明显增加,与LPS刺激相比,VitB6及LPS处理后细胞炎症因子表达无明显变化。6.VitB6通过DOK3蛋白抑制LPS诱导的炎症在体外实验中提取DOK3-/-小鼠腹腔巨噬细胞,种板,12小时后,予以VitB6及LPS处理24小时,提取细胞总mRNA检测炎症因子的表达水平。LPS组与对照组相比,炎症因子表达明显增加,VitB6+LPS组与LPS组相比炎症因子表达水平无明显降低。在DOK3-/-小鼠腹腔巨噬细胞中转染腺病毒,过表达DOK3基因,24小时后换液,12小时后给予VitB6和LPS处理,空载体组,LPS与VitB6+LPS两组相比炎症因子表达无明显差异,然而腺病毒过表达组,LPS与VitB6+LPS两组相比,VitB6+LPS组炎症因子水平明显低于LPS组。在体内实验中,对DOK3-/-小鼠腹腔注射VitB6(20mg/kg)或生理盐水,6小时后予以LPS(0.5mg/kg)处理,24小时后行安乐死,留取血清、肺组织等,检测血清及肺组织中炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白的表达量;结果与细胞实验结果一致。实验结论1.在巨噬细胞中VitB6明显增加pAMPK蛋白的表达水平。2.在巨噬细胞中VitB6显著抑制LPS诱导的pDOK3蛋白的表达。3.VitB6通过AMPK蛋白明显降低LPS诱导的炎症水平。4.VitB6通过DOK3蛋白显著抑制LPS诱导的炎症水平。5.在体内实验和体外实验中,VitB6通过AMPK-DOK3信号通路抑制LPS诱导的急性肺部炎症水平。