【摘 要】
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D-阿洛酮糖属于己酮糖,是D-果糖C-3位对应的差向异构体。因低能量、高甜度的特点,可作为新型甜味剂应用于食品工业生产。酮糖3-差向异构酶（KEase）可以催化D-果糖发生差向异构化反应生成D-阿洛酮糖。已报道的KEase普遍存在热稳定性较差的问题,难以适应KEase工业化应用需求。本课题综合运用分子动力学模拟和基因挖掘技术,筛选得到一种来源于Labedella endophytica的耐热型KE
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D-阿洛酮糖属于己酮糖,是D-果糖C-3位对应的差向异构体。因低能量、高甜度的特点,可作为新型甜味剂应用于食品工业生产。酮糖3-差向异构酶（KEase）可以催化D-果糖发生差向异构化反应生成D-阿洛酮糖。已报道的KEase普遍存在热稳定性较差的问题,难以适应KEase工业化应用需求。本课题综合运用分子动力学模拟和基因挖掘技术,筛选得到一种来源于Labedella endophytica的耐热型KEase,通过生物信息学分析和酶学性质的鉴定,将其归类为L-核酮糖3-差向异构酶（LREase）。L.endophytica LREase兼具耐热和耐酸特性,且催化活力较高,是D-阿洛酮糖工业化生产的优良酶制剂。本课题主要研究以下内容:（1）耐热型KEase的定向挖掘。运用新酶挖掘工具Enzyme Miner,建立耐热型KEase初筛文库;基于分子动力学模拟,开展计算辅助的耐热型KEase复选,以不同微生物来源KEase的均方根偏差（RMSD）和氢键数目为指标,建立耐热型KEase复筛文库;通过KEase的热力学性质表征,终选出具有耐热性潜质的L.endophytica KEase;序列一致性和进化发生树分析表明,L.endophytica KEase是潜在的LREase。（2）L.endophytica LREase的异源表达和产酶条件优化。构建重组质粒p ET22b（+）-Laen转入E.coli BL21（DE3）,诱导目的蛋白过量表达;通过培养基组分和培养条件优化,重组菌在培养温度20℃下诱导表达24 h,酶活达到54.42±0.86 U/m L,较优化前提升5.46倍。（3）L.endophytica LREase的酶学性质研究。通过Ni2+亲和层析柱分离纯化得到L.endophytica LREase,酶学性质研究表明,L.endophytica LREase的最适反应温度为80℃,最适p H为6.0,最适金属离子为Ni2+,最适底物为L-核酮糖。以D-果糖为反应底物时,L.endophytica LREase的比酶活为110.7±0.3 U/mg,动力学参数kcat、Km和kcat/Km值分别为4077.8 min-1,49.6 m M和82.3 m M-1 min-1,表现出对D-果糖较强的催化活力。酶的热力学性质研究表明,在Co2+的孵育下,L.endophytica LREase在60℃、65℃和70℃下半衰期(t1/2)为37.7 h、9.0 h、4.6 h,解折叠温度（Tm）为80.91℃,展现出极强的耐热性特征。（4）L.endophytica LREase的储藏和生产研究。L.endophytica LREase在稳定剂Co2+存在下4℃和25℃时的储藏t1/2值为28 d和16 d;在p H 6.0、温度70℃、底物D-果糖500 g/L的条件下,L.endophytica LREase可生产合成154.2 g/L的D-阿洛酮糖,平衡转化率为30.8%。
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