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为了获得具有降解纤维素能力的基因工程改造乳酸菌，进而解决瘤胃纤维降解菌耐酸性差的问题，本研究利用现代分子生物学技术对康宁木霉AS3.2774纤维素酶CBHⅡ基因进行了克隆与表达。
本试验包括三部分：(1) 康宁木霉AS3.2774菌种的恢复培养与诱导培养。通过马铃薯琼脂培养基(PDA)对真空冷冻干燥菌种进行平板活化，28℃恒温培养5天。之后对活化好的菌株用Mendels培养基，200转/分，30℃诱导培养4天。4℃，4000转/分，10分钟，离心收集菌体，-70℃保存。(2)康宁木霉AS3.2774 CBHⅡ基因的克隆与测序。根据Genebank已发表的纤维素酶CBHⅡ基因序列(DQ504304)，利用Premier5.0软件设计并合成了一对引物，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，从康宁木霉AS3.2774的总RNA中扩增CBHⅡ全长基因，琼脂糖凝胶回收纯化目的基因。通过T4DNA连接酶将其直接连于克隆载体pMDl8-T Simple，构建重组质粒pMD18-T-CBHⅡ，再转化至克隆宿主菌DH5a。利用蓝白斑筛选阳性克隆，然后提质粒、酶切、PCR鉴定、序列测定并经DNAMAN分析，证明重组质粒pMD18-T-GBHⅡ中是否含有CBHⅡ基因。(3)康宁木霉AS3.2774 CBHⅡ基因的表达与检测。利用SmaⅠ和SphⅠ对重组质粒pMD18-T-CBHⅡ和以胸苷酸合成酶基因(Thymidylate synthase，ThyA)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t进行双酶切反应，并将纯化的CBHⅡ基因亚克隆至表达载体pW425t中，构建出可以在乳酸菌和大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-CBHⅡ。将pW425t-CBHⅡ转化至ThyA基因缺陷性大肠杆菌E.coilx13中，利用生长功能弥补筛选阳性克隆并鉴定，将阳性克隆pW425t-CBHⅡ在EX13进行表达，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其表达情况。
试验结果：(1)康宁木霉AS3.2774，经过5天的PDA恢复培养，菌体生长旺盛，菌丝较长，分枝较多，能形成大量分生孢子，菌落呈深绿色。Mendels诱导培养中，菌体以松散的菌丝体形态存在，诱导剂微晶纤维素能够诱导康宁木霉AS3.2774CBHⅡ基因的mRNA表达。(2)实验成功克隆了康宁木霉AS3.2774 CBHⅡ的CDNA全长，开放阅读框(ORF)长度为1413bp，编码470个氨基酸，推测的蛋白分子量为49.6KD。与参考DNA序列的开放读码框的同源性为99.8％，证实获得了基因的正确性。(3)实验成功构建了重组表达载体pW425t-CBHⅡ，并在表达宿主菌EX13中进行表达，SDS-PAGE分析CBHⅡ在EX13中得到表达，蛋白分子量约49.6KD，从而为下一步在乳酸菌中表达奠定基础。本研究为纤维素酶CBHⅡ的新型利用提供了思路和可能，也为各种外源和内源的功能基因通过pW425t表达载体在肠道共生乳酸菌中表达而更好的发挥转基因工程乳酸菌的双重功能开创了一条崭新的道路。