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本研究旨在通过对河北医科大学和白求恩国际和平医院2003年3月～2004年3月临床分离的至少对一种三代头孢菌素耐药的革兰阴性杆菌产生的BLA表型分析，揭示质粒AmpCβ-内酰胺酶阳性的革兰阴性杆菌的流行特点及主要质粒耐药基因型别。
研究方法：
1.用K-B纸片扩散法检测细菌耐药表型特点。
2.采用改良三维试验方法检测BLA表型。即用灭菌棉棒蘸取0.5麦氏单位的大肠埃希菌ATCC25922菌液均匀涂抹MH琼脂平板，10分钟后于平板中央贴一含30μg头孢曲松的纸片(Ceffriaxone，CRO)，距纸片边缘5mm处放射状打4个长10mm、宽1mm的槽，相邻两槽互为直角。分别于槽内加45μl粗提酶液+5μl生理盐水、45μl粗提酶液+5μl氯唑西林(CLO)、45μl粗提酶液+5μl克拉维酸(CLA)、45μl粗提酶液+2.5μl克拉维酸+2.5μl氯唑西林后，置35℃培养24h。以粗提酶液周围长出细菌，抑菌环缺损，形成一指向CRO的矢状菌苔，即为产酶阳性。无矢状菌苔者为阴性。产酶阳性者，CLO单独加入时抑制试验为阳性，即该菌AmpCβ-内酰胺酶检测阳性；CLA单独加入时抑制试验为阳性，即该菌ESBLs检测阳性；CLO或CLA单独加入不能抑制酶活性(抑酶试验阴性)，同时加入CLA和CLO时抑酶试验为阳性，说明该菌同时产生ESBLs和AmpC两种酶；当同时加入CLA和CLO时抑酶试验仍为阴性，若被EDTA等抑制，则为金属β-内酰胺酶。此时平板中央须贴一片10μg亚胺培南纸片代替头孢曲松纸片。若酶不能被酶抑制剂CLA、CLO、EDTA抑制，该菌可能为产非AmpC、ESBLs及金属酶的其它β-内酰胺酶阳性，如耐抑制剂广谱酶等。以肺炎克雷伯氏菌ATCC700603为ESBLs阳性对照，以阴沟肠杆菌029M为AmpC酶阳性对照，以大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照。
3.对AmpCβ-内酰胺酶(含同时产ESBLs和AmpC两种酶者)阳性株用碱裂解法提取细菌质粒，进行转化试验，再次提取转化子质粒，以两种质粒作模板，设计5对5群基因型(CMY-1、CMY-2、DHA、ACT、FOX)引物，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳初步鉴定，并取阳性扩增产物回收，测序。以大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照，试剂盒所携带的阳性模板为阳性对照。
研究结果：
1.受试236株革兰阴性杆菌中共有29株产酶阳性，产酶率为12.3％。其中单纯产AmpCβ-内酰胺酶17株，阳性率为7.2％；单纯产ESBLs8株(3.4％)；AmpCβ-内酰胺酶和ESBLs均阳性2株(0.8％)；2株为非高产AmpC酶、ESBLs、金属酶(0.8％)。因此共检出产AmpCβ-内酰胺酶菌株19株，检出率为8.1％。未发现金属酶阳性株。
2.19株AmpC酶阳性菌株对常用抗生素呈现多重耐药性。除对亚胺培南和头孢吡肟全部敏感外，对其它各类药物均呈现不同程度的耐药。对氨基青霉素耐药率为89.5～100％；第三代头孢菌素的耐药率为68.4～9.5％；氨曲南耐药率为78.9％；氨基糖苷类为68.4～78.9％；氟喹诺酮类为73.7～84.2％。其耐药率明显高于非产酶株的耐药率，约为1.2-2.44倍(P＜0.05)。
3.19株产AmpCβ-内酰胺酶阳性株分别为大肠埃希菌(36.8％)；肺炎克雷伯菌(26.3％)；阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌(各15.8％)及粘质沙雷氏菌(5.3％)。来源于痰标本(47.4％)；烧伤创面分泌物(21.1％)。主要来自老年病房(31.5％)、呼吸内科(26.3％)、烧伤科(21.1％)。以患重症肺炎(42.1％)；大面积烧伤(21.1％)；恶性肿瘤(10.5％)的病人为主要易感人群。
4.产质粒AmpCβ-内酰胺酶菌株的转化株保留了对头孢西丁、三代头孢菌素的耐药性，对四代头孢菌素及碳青酶烯类亚胺培南的敏感性与临床分离株相近。
5.19株AmpCβ-内酰胺酶阳性的革兰阴性杆菌质粒耐药基因型结果为：5株DHA-1型阳性，2株ACT-1阳性，未发现CMY-1、CMY-2、FOX阳性株，13株5种基因型均阴性。源于含耐药基因临床菌株的转化株也同时检测到了该耐药基因，更加有力地说明耐药基因是存在于质粒上的。耐药基因分别检出于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌及阴沟肠杆菌。6对DHA-1和ACT-1基因扩增产物经测序，与GenBank上的DHA-1和ACT-1基因序列完全相同。
研究结论：
1.应用改良三维试验方法检测革兰阴性杆菌的产酶表型，在实际工作中是切实可行的。
2.本组资料显示临床分离出的菌株中产AmpCβ-内酰胺酶的菌株阳性率为8.1％。以前多侧重ESBLs的检测，对AmpCβ-内酰胺酶的研究较少，应引起高度重视。
3.产质粒介导AmpCβ-内酰胺酶的细菌耐药率比较高，对头孢西丁及第一、二、三代头孢菌素均耐药。可供临床经验用药选择的只有四代头孢菌素如头孢吡肟和碳青酶烯类如亚胺培南等。
4.产质粒介导的AmpCβ-内酰胺酶的阳性株主要来源于痰及烧伤分泌物，以老年病房、呼吸科及烧伤科为主，重症肺炎、恶性肿瘤、烧伤病人为主要易感人群。
5.本组产质粒AmpCβ-内酰胺酶阳性株检出了2型耐药质粒基因，即DHA-1和AC-1两个亚型，其余耐药基因型未检出。质粒介导的AmpCβ-内酰胺酶主要存在于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌等肠杆菌科细菌中，但也从不动杆菌中检出了耐药基因。从耐药基因的菌种分布来看，质粒介导的AmpCβ-内酰胺酶存在着跨种属传播，导致耐药性播散的可能。本地区还未见这方面的报道。