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研究目的:金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病菌,其本身杀伤性不大,但在食品中大量繁殖之后可产生金黄色葡萄球菌肠毒素。金黄色葡萄球菌肠毒素对肠道破坏性大,常引起金黄色葡萄球菌肠炎,该病起病急,中毒症状严重,临床症状主要表现为呕吐、发热、腹痛、腹泻和休克等,严重可导致循环衰竭。目前,针对金黄色葡萄菌的实验室检测方法,主要有传统分离培养生化鉴定法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法。但这些方法存在着操作复杂、耗时长、灵敏性低、特异性差、对实验条件和操作人员要求较高等缺点。因此,建立一种操作简单、快速、灵敏且准确的金黄色葡萄球菌的检测方法对预防和控制由金黄色葡萄球菌引发的食品安全问题十分必要。本课题旨在通过卵黄抗体技术、免疫磁分离技术、TMB（3,3’,5,5’-四甲基联苯胺）-HRP（辣根过氧化物酶）-H2O2（过氧化氢）显色体系,建立一种金黄色葡萄球菌快速可视化检测方法,并对所建立的检测方法进行评价,为食品安全监督防控提供一定的技术支撑。研究方法:1.金黄色葡萄球菌鸡卵黄抗体的制备与鉴定以金黄色葡萄球菌灭活菌液作为抗原,与弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂以1:1的比例混合制备疫苗,采用鸡胸多点注射免疫的方式对SPF级蛋鸡进行免疫,收集免疫后的鸡蛋。采用PEG-6000沉淀法对蛋黄中的鸡卵黄抗体进行分离提取;采用间接ELISA法检测所提取鸡卵黄抗体的效价和特异性;采用SDS-PAGE电泳测定抗体纯度;采用BCA蛋白浓度定量法测定抗体的蛋白含量。2.免疫磁珠的制备及表征采用溶剂热法合成表面修饰羧基的Fe3O4纳米粒子,以EDC和NHS作为偶联剂,将制备好的羧基磁珠与鸡卵黄抗体偶联,制备可以对待测的金黄色葡萄球菌进行特异性分离和富集的免疫磁珠。采用生物透射电子显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、磁学测量系统（SQUID-VSM）分别对所制备的功能化羧基磁珠和免疫磁珠的组成、尺寸、形貌和性能进行表征。3.金黄色葡萄球菌检测方法的建立与评价采用上述所制备的免疫磁珠对待测样品中的金黄色葡萄球菌进行快速捕获与富集分离后,向该免疫磁性复合物中加入H2O2溶液。小分子H2O2将会迅速透过金黄色葡萄球菌的细胞膜,并被其中的过氧化氢酶催化分解。磁性分离后取剩余的溶液与HRP和TMB进行显色反应,通过UV-Vis检测该体系吸光度的变化和对形成产物颜色的深浅进行肉眼观察,实现待测样品中金黄色葡萄球菌的定量以及可视化的快速检测。为达到最佳检测效果,对免疫磁珠用量、富集时间、H2O2用量、H2O2分解反应时间、显色液pH值、HRP浓度、TMB浓度进行优化,并对该检测体系的灵敏度、准确度、特异性、重复性进行评价,最后使用该检测方法对人工模拟的牛奶样品进行检测。研究结果:1.金黄色葡萄球菌鸡卵黄抗体的制备与鉴定鉴定结果显示,本实验所制备的鸡卵黄抗体效价为1:64000;特异性较好,能特异性识别金黄色葡萄球菌,而不能与大肠杆菌O157:H7型、副溶血性弧菌、鲍氏志贺氏菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌、阪崎肠杆菌、奇异变形杆菌等细菌结合;电泳结果显示杂带较少且目标条带清晰;抗体蛋白含量为21.78 mg·mL-1。2.免疫磁珠的制备及表征透射电镜结果显示所合成的纳米粒子呈球形,均一、分散,表面略粗糙。羧基磁珠的平均粒径为240nm,免疫磁珠的平均粒径为281.7nm。红外光谱显示,免疫磁珠在1612 cm-1处出现了肽键中C=O特征吸收峰,说明鸡卵黄抗体IgY成功偶连在了羧基磁珠表面。磁学测量系统显示,功能化羧基磁珠和免疫磁珠均具有良好的超顺磁性,IgY偶连在羧基磁珠表面后免疫磁珠的饱和磁化率有轻微的降低,由59.286 emu/g降至52.039 emu/g,但仍然具有外磁场快速响应能力。3.金黄色葡萄球菌检测方法的建立与评价条件优化结果显示,当免疫磁珠浓度为0.6 mg·mL-1,富集时间为60 min时富集效率最高,可达到91.4%;H2O2的最佳用量是50μL;H2O2最佳分解反应时间为2 min;显色液的最佳pH值为4.5;HRP最佳浓度为2.5μg·mL-1;TMB的最佳浓度为2.0 mg·mL-1。在最佳检测条件下,金黄色葡萄球菌浓度在103107CFU·mL-1范围内,反应产物在654nm处的吸光度值与金黄色葡萄球菌浓度的对数呈线性关系,线性方程为y=-0.256x+1.864（R2=0.992）,检测限为103 CFU·mL-1,该方法的准确度、特异性良好,应用该方法检测牛奶模拟样,检测限为103CFU·mL-1,加标回收率在96.57%104.96%之间,相对标准偏差在7.28%7.78%之间。该方法在75 min内即可完成检测,裸眼可判定检测结果,满足金黄色葡萄球菌现场快检的要求。研究结论:1.本课题建立了一种基于卵黄抗体技术、免疫磁分离技术、TMB-HRP-H2O2显色体系的金黄色葡萄球菌快速可视化检测方法。2.该检测方法的检测限为103 CFU·mL-1,特异性较好,且具有较好的稳定性,为实现食品中金黄色葡萄球菌的快速检测奠定实验基础。