产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing E.coli,STEC）感染是一种重要的人畜共患病,对人类健康构成巨大威胁。目前,临床主要采用抗生素、血液透析等非特异性疗法治疗STEC感染,但存在疗效差、抗生素耐药性等问题。目前尚未有STEC特异性药物用于临床治疗,缺乏同时针对STEC黏附和其释放的志贺毒素（Shiga toxin,Stx）的双特异性药物研究。纳米抗体来源于骆驼科等动物体内的一种独特抗体的重链可变区,是目前具有完整抗原结合功能的最小抗体结构,具有亲和力高、稳定性强,溶解度高,组织渗透力强等优势,在抗感染领域具有巨大的应用前景。本研究选取已报道的抗Stx2 B亚基（Stx2B）纳米抗体Nb113和抗Intimin纳米抗体IB10,通过基因工程策略将两种纳米抗体重组表达,构建了同时针对Stx和Intimin的双特异性中和纳米抗体Nb113-IB10。首先,通过优化发酵和纯化条件,制备获得Nb113-IB10重组蛋白;随后,通过酶联免疫吸附、免疫共沉淀、流式细胞术等手段,综合评价了Nb113-IB10与各自抗原靶点的结合活性及其中和保护活性;最后,评估了Nb113-IB10分别在模拟肠道极端p H及不同温度和反复冻融保存条件下的稳定性。其主要结论如下:（1）以G4S为柔性连接臂,将抗Stx2B纳米抗体Nb113和抗Intimin纳米抗体IB10进行融合表达,构建了Nb113-（G4S）3-IB10重组蛋白。经原核发酵条件优化,其最佳表达条件为16℃,1 m M IPTG诱导剂,最终产量达到4.5 mg·L-1。（2）抗原结合活性分析表明,Nb113-IB10重组蛋白与Stx2B、Intimin的半数结合浓度分别为296 n M和46 n M,分别是对应单价纳米抗体的8.6倍和2.7倍;同时,Nb113-IB10重组蛋白可以同时结合Stx2B、Intimin,表明其具有双边抗原结合活性。（3）抗原中和实验表明,Nb113-IB10重组蛋白对Stx2B结合Gb3的半数抑制浓度为134 n M,对Intimin结合Tir的半数抑制浓度为475 n M;同时,Nb113-IB10重组蛋白在一端结合了抗原的情况下,可以抑制另一端受体的结合,表明其具有双边抗原中和活性。细胞水平中和实验证明,Nb113-IB10重组蛋白可以有效抑制Stx2B与Gb3受体的结合。（4）Nb113-IB10重组蛋白在不同温度和冻融保存条件及模拟肠道极端p H条件下,具有蛋白质稳定性并且维持了较高的STEC抗原中和活性,具有口服和吸入式给药的潜力。