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背景与目的胃癌(Gastric cancer)作为最常见的消化道恶性肿瘤,在我国其新增患病人数和死亡人数均居前列。目前,传统的胃癌诊断方法有X射线钡餐双重造影法、纤维内窥镜检查、B超以及CT检查等。但是,这些方法灵敏性不高,对于初期胃癌患者易造成漏诊,从而错过最佳治疗时机。另外,胃癌治疗的主要措施包括手术切除、物理放射治疗、化疗等传统方式的联合治疗,但是切除疗法有着容易错过手术时机、难以切除彻底、术后易于复发等问题,而放、化疗毒副作用巨大,缺乏靶向性导致治疗效果不佳且易复发。基因诊治作为近年来新兴起的一种诊治手段,在癌症的诊疗以及预后评估中优势明显,以肿瘤基因为靶向的基因治疗有望为肿瘤等恶性疾病的治疗带来曙光。所以,肿瘤相关基因的功能研究在这样的背景下显得更加重要。通过对胃癌的发生、发展过程中涉及基因功能的探究进而实现对胃癌的基因诊治,有可能是解决胃癌临床瓶颈问题的途径之一。转移、复发是癌症的重要恶性标志,而这取决于癌细胞的恶性度即其大大加强的增殖力、运动力等等。在肿瘤发生过程中,肿瘤细胞能够经上皮间充质转化(EMT)途径获得细胞的恶性表征。经研究发现,EMT过程与多种基因的异常表达相关联。目前常用基因功能的研究方法有基因敲除(Knockout/Deletion)法及基因敲低(Knockdown/Inhibition)法。基因敲除法在细胞基因组水平从转录水平彻底消除基因表达并能获得稳定的细胞系,一经敲除可长期用于研究。相比于基因敲除,基因敲低的方法在转录后水平或者翻译后水平部分抑制基因表达,操作简单,周期短,成本低廉,常用基因敲低法为RNA干扰(RNAi)技术。本室以前的研究提示LEF-1(Lymphoid enhancing factor-1)在多种恶性肿瘤细胞及组织中过高表达,并且与恶性肿瘤的发生、发展进程密切相关。为了研究LEF-1表达与胃癌恶性病程发展的联系,探究它在胃癌发展中的意义,本课题以RNAi技术下调LEF-1的表达,研究了 LEF-1与胃癌细胞(SGC-7901)的运动力、增殖力、细胞运动相关微结构发育的关系,为了探讨LEF1与胃癌EMT可能的关系,对LEF1对EMT相关基因的表达的影响也做了研究。方法1.以NCBI数据库检索LEF-1的基因信息,在线设计针对LEF-1的shRNA,Blast Hit检测特异性后将LEF1-shRNA克隆至含有GFP报告基因的质粒载体pU6.1-GFP 中,构成 pU6.1-GFP/LEF1-shRNA。2.将制备好的pU6.1-GFP/LEF1-shRNA采用磷酸钙转染法导入人胃癌细胞SGC-7901中,以错义对照pU6.1-GFP/shRNAscr转染组和野生细胞组作为对照,转染48h后评估转染效率。3.选用损伤修复实验和Transwell法检测LEF-1的表达被抑制后人胃癌细胞SGC-7901运动力的变化。4.选用MTT法、平板克隆形成实验检测LEF-1的表达被抑制后SGC-7901细胞增殖能力的变化。5.运用免疫荧光标记法、免疫细胞化学法及考马斯亮蓝染色法对LEF-1下调后细胞骨架相关蛋白F-actin、β-tubulin及核纤层蛋白LaminB1进行观察研究。6.扫描电镜下观察LEF-1的表达被抑制后SGC-7901细胞形态和相关微结构的变化。7.以蛋白免疫印迹法(Western blot)及免疫细胞化学法检测LEF-1的表达被抑制后,EMT标志物基因E-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达的变化。8.用生物信息学方法分析基因LEF-1在肿瘤尤其在胃癌的突变情况,初步分析和预测与该基因联系密切的相关基因。结果1.成功构建了靶向LEF-1的shRNA重组质粒,磷酸钙共沉淀法转染SGC-7901细胞效率达80%以上。2.重组质粒LEF1-shRNA可以明显抑制SGC-7901细胞LEF-1表达。3.损伤修复实验、Transwell实验的结果表明LEF-1基因表达下调后SGC-7901细胞运动能力显著下降。4.MTT法、平板克隆实验结果提示LEF-1基因表达下调后SGC-7901细胞的增殖能力显著下降。5.免疫染色的结果表明,LEF-1的表达被抑制后,细胞F-actin的表达减少,分子聚合度降低,纤维束减弱;β-tubulin的表达减弱并出现解聚现象,所形成的微管分布组织性弱化;Lamin B1的表达量下降,进一步检测发现细胞中LaminB1的平均光密度值有一定程度的降低。考马斯亮蓝染色的结果表明细胞的整体骨架发育不良,运动有关的结构发育受到抑制。6.扫描电镜检测的结果表明,LEF-1的抑制使细胞整体形态发生改变,细胞表面微绒毛及运动相关结构发育抑制,并且呈时间依赖性。7.Western blot、免疫细胞化学结果表明抑制LEF-1的表达后,EMT相关基因E-cadherin的表达增加,Vimentin和Snail的表达均降低。结论1.LEF-1的表达下调能够有效抑制SGC-7901细胞的运动、增殖能力。此外,还能有效抑制细胞运动相关微结构的变化,并引起细胞骨架系统的重塑进而导致细胞的恶性程度发生改变。这些改变说明LEF-1在胃癌细胞的增殖、扩散、转移、侵袭等癌症病程发展的关键环节中发挥着重要的促进作用。2.Western blot及免疫荧光实验的结果表明基因LEF-1的表达与EMT标志物基因E-cadherin、Vimentin、Snail的表达呈现出相关性。提示LEF-1可能在胃癌的发生阶段起重要作用。3.本课题从探究胃癌细胞恶性表型及EMT标志物基因的角度说明LEF-1基因参与胃癌的发生与发展进程,提示LEF-1可以作为人胃癌诊治方面的潜在靶点。4.生物信息学分析结果表明基因LEF-1在多种恶性肿瘤中异常表达,其在基因及蛋白质水平均发生不同程度的变异。该基因与APC、MMP9、TCF7及BGN等基因密切相关,LEF-1有望在未来成为胃癌诊治的靶点。