【摘 要】
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核盘菌是一种植物病原真菌,在世界范围内均能引起多种重要农作物,如油菜等油料作物的产量及品质下降,造成严重的经济损失。由于缺少油菜的抗病种质资源,使得针对油菜菌核病抗性基因的发掘和鉴定研究进展缓慢,因此,控制核盘菌的侵染循环为培育有效的抗病油菜品种提供了新的思路。本研究前期通过转录组分析发现与编码IgE-binding同源蛋白的核盘菌基因SS1G_08110(Ssebp)在侵染甘蓝后高度表达,推测该
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核盘菌是一种植物病原真菌,在世界范围内均能引起多种重要农作物,如油菜等油料作物的产量及品质下降,造成严重的经济损失。由于缺少油菜的抗病种质资源,使得针对油菜菌核病抗性基因的发掘和鉴定研究进展缓慢,因此,控制核盘菌的侵染循环为培育有效的抗病油菜品种提供了新的思路。本研究前期通过转录组分析发现与编码IgE-binding同源蛋白的核盘菌基因SS1G_08110(Ssebp)在侵染甘蓝后高度表达,推测该基因可能与核盘菌致病过程相关,因此本研究以该基因作为候选基因进行功能分析,同时探究其在抗病育种中的应用潜力。主要研究结果如下:(1)生物信息学分析:Ssebp基因组序列全长为619 bp,CDS序列长为567bp,共编码189个氨基酸,有信号肽结构,无跨膜结构域,推测该基因编码的蛋白可能是一个分泌蛋白。(2)基因表达特性分析:通过qRT-PCR分析Ssebp基因在菌丝生长的不同时间点及不同侵染条件下的表达情况,结果观察到在PDA上生长2 d时,即在菌丝生长期,基因表达量最高;在接种油菜12 h后,基因表达量显著升高。实验结果表明Ssebp基因可能与菌丝生长及侵染有关。(3)转化子筛选及表型分析:通过构建Ssebp基因沉默表达及超表达载体,利用PEG介导的原生质体转化野生型核盘菌1980,在含潮霉素的PDA平板上进行筛选,成功筛选出6个阳性沉默转化子和2个阳性超表达转化子。qRT-PCR分析发现6个Ssebp基因沉默转化子的表达量相对野生型菌株均有所下降,两个超表达转化子的表达量相对野生型菌株上升。表型分析发现,沉默转化子菌丝生长速度显著减慢,形成侵染垫以及致病能力显著减弱。超表达转化子菌丝生长相比野生型显著加快,致病能力增强。(4)转基因拟南芥表型分析:构建Ssebp基因的HIGS载体,同时构建Ssebp基因的植物超表达载体,转化拟南芥Col-0,利用红光表达载体盒进行纯合株系的筛选。经过世代筛选后,接种核盘菌并分析转基因株系的菌核病抗性。结果发现T3代纯合转基因株系中,HIGS转基因叶片病斑大小显著小于野生型拟南芥,Ssebp超表达转基因拟南芥的菌斑显著大于野生型拟南芥。该结果说明在拟南芥中表达靶向核盘菌Ssebp基因的ds RNA,能显著增强转基因植株的抗病性,而在植物中表达Ssebp能显著降低植物的菌核病抗性。(5)转录组分析:通过对不同菌株接种不同植物后的转录组数据分析,发现拟南芥的差异基因在对毒素的代谢过程、对伤害的反应及对茉莉酸反应的信号途径方面富集显著。推测核盘菌Ssebp基因可能通过影响植物PTI过程,参与核盘菌的致病过程。
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