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目的:研究PM2.5慢性暴露对小鼠肺损伤的机制,以及PM2.5刺激对巨噬细胞自噬水平的影响,探讨自噬活动与PM2.5所致肺损伤之间的关系,并阐述其可能的调节机制以及用复方精油的保护效果。这些发现对于PM2.5诱导机体肺损伤提供了新的潜在治疗策略。方法:1.PM2.5样品采集、处理及成分分析:利用PM2.5颗粒采样器采集2015年10月-2016年3月中国河北廊坊地区的PM2.5,将收集的PM2.5石英滤膜放入70%乙醇溶液中浸泡,超声处理6-8次,每次20-30 min,使PM2.5颗粒与滤膜分离悬浮于溶液中,8层纱布过滤,后经旋转蒸发、冷冻干燥去除水分,放入-20°C冰箱备用。准确称取一定量的PM2.5颗粒,用无菌生理盐水配置成10 mg/mL悬液,使用前超声震荡。利用碳硫分析仪、离子色谱仪、光谱仪、气相色谱-质谱联用仪对提取的PM2.5进行了元素碳、水溶性离子、金属元素、有机碳、多环芳烃化合物的检测。2.体内实验:Balb/c小鼠经PM2.5（300 mg/m3）慢性暴露及1%复方精油（生理盐水配置）静态吸入干预作用。记录了16个周小鼠体重及第16周小鼠安乐死后肺组织重量,计算肺脏系数,分析PM2.5对小鼠体重和肺脏影响;采用苏木素-伊红（HE）染色、白细胞计数及免疫组化法,观察小鼠肺组织病理变化、白细胞数目改变以及巨噬细胞激活状态,分析肺病变情况;利用透射电子显微镜,检测并观察PM2.5慢性暴露后小鼠肺组织自噬小体的改变;利用实时qPCR法检测肺组织自噬基因beclin1以及TLR4、P53、AMPK、mTOR的表达,利用蛋白质印迹法检测小鼠肺组织beclin1、LC3B、TLR4、P53、AMPK、P-AMPK、mTOR、P-mTOR表达情况。3.体外实验:利用CCK-8法检测PM2.5对RAW264.7细胞的存活率的影响;应用MDC、免疫荧光法检测PM2.5暴露后RAW264.7细胞自噬水平,应用自噬抑制剂3-MA,确定PM2.5诱导的自噬与PM2.5暴露引起细胞损伤相关。应用TLR4抑制剂TAK-242,确定PM2.5诱导的自噬与TLR4激活相关。用复方精油干预处理后,探究复方精油对于PM2.5暴露造成的病变的保护作用的分子机制。利用实时qPCR法检测自噬基因beclin1,通路基因TLR4、P53、AMPK、mTOR的表达,利用蛋白质印迹法检测beclin1、LC3B的变化以及TLR4、P53、AMPK、P-AMPK、mTOR、P-mTOR表达情况。判断TLR4介导的P53/AMPK/mTOR通路在PM2.5诱导自噬上调的作用。结果:1.PM2.5成分分析:所提取的PM2.5样品,主要成分如下:碳成分为有机碳、元素碳,水溶性离子以NO3-、SO42-及Na+为主,金属元素主要以Na、Ca、Al,重金属以Fe、Zn、Cu为主,而多环芳烃类化合物未检出。2.体内实验:16周作用后,三组小鼠体重均呈现上升趋势,但PM2.5和精油干预作用引起部分小鼠体重减轻,且16周后PM2.5组小鼠肺组织重量和肺脏系数均比对照组大,且有统计学意义,说明PM2.5可能会沉积在肺中,引起肺水肿、纤维化等病变。HE染色及白细胞计数结果表明:PM2.5慢性暴露后的小鼠肺脏发生出血、炎症细胞增多,精油干预后肺脏出血减轻、炎症细胞减少。免疫组化结果表明:PM2.5慢性暴露后巨噬细胞被激活。PM2.5暴露组中,透射电镜结果发现出现明显自噬小体及自噬溶酶体,免疫组化结果显示LC3B表达增多,实时荧光定量qPCR显示自噬相关基因beclin1增多,Western blot结果表明自噬相关蛋白LC3B、beclin1表达增多,以上结果说明PM2.5慢性暴露导致小鼠肺组织的自噬水平上调;实时qPCR、Western blot结果表明TLR4可能介导P53/AMPK/mTOR通路参与PM2.5暴露诱导的自噬过程。3.体外实验:CCK-8结果显示,随着PM2.5染毒剂量的增加,RAW264.7细胞存活率逐渐降低;MDC、LC3B免疫荧光染色、实时荧光定量、qPCR、Western blot结果表明PM2.5暴露引起自噬水平上调,应用自噬抑制剂3-MA处理后,PM2.5暴露诱导的自噬水平明显降低。实时qPCR、Western blot结果显示PM2.5暴露后TLR4、P53、AMPK基因和蛋白表达均增多,mTOR基因蛋白水平减少;应用TLR4抑制剂TAK-242处理后,PM2.5引起的自噬被抑制,TLR4、P53、AMPK相关基因蛋白表达明显下降,mTOR基因和蛋白的表达增加;复方精油处理后,RAW264.7细胞自噬相关蛋白、TLR4、P53、AMPK蛋白表达均被抑制,mTOR的表达上升。与体内实验相一致的是,复方精油处理后,PM2.5暴露引起自噬水平上调被抑制,引起的肺损伤得到了缓解。结论:PM2.5暴露使肺组织发生出血、炎症细胞聚集等病理上的变化,使巨噬细胞存活率降低;PM2.5暴露引发肺组织、巨噬细胞自噬水平上调,PM2.5诱导的自噬可能通过激活TLR4受体介导P53/AMPK/mTOR通路引起。复方精油可以缓解PM2.5暴露导致的肺组织和巨噬细胞的损伤;复方精油可能通过抑制TLR4从而改善过度自噬所导致的肺脏和巨噬细胞的损伤。