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泽泻（Alismatis Rhizoma）是泽泻科植物泽泻[Alisma orientatle（Sam.）Juzep.]的干燥块茎,临床上常被用于治疗水肿、尿少、高脂血症等疾病。现代研究表明泽泻中含有三萜、倍半萜、生物碱、脂肪酸等化学成分,其中三萜类化合物是泽泻的主要药效成分。《中华人民共和国药典》（2010年版一部）开始,23-乙酰泽泻醇B（泽泻醇B-23-醋酸酯,Alisol B 23-acetate,ABA）被用作泽泻药材和饮片含量测定的唯一指标性成分。药理学研究证明泽泻中的三萜类成分具有利尿、肾保护、肝保护、降血脂等多种生物活性。基于中医理论,治疗慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）是泽泻的主要临床应用之一。然而,目前泽泻治疗CKD的研究较少,尤其关于其抗肾纤维化物质基础及其作用机制的研究严重缺乏,这不仅阻碍泽泻的新药开发而且限制中药的现代化和国际化。因此,本文研究了泽泻抗肾纤维化的物质基础及其作用机制。目的:1.筛选泽泻的利尿活性部位,系统分离和鉴定活性部位的化学成分,明确泽泻发挥肾保护作用的物质基础。2.评价泽泻活性部位主要化学成分的抗肾纤维化作用,揭示其抗肾纤维化的作用机制,为治疗CKD新药的开发提供参考和实验依据。方法:1.泽泻药材粉碎后分别用水和乙醇提取,得到水提取物和乙醇提取物。乙醇提取物依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取。采用生理盐水负荷的大鼠模型首先评价水提取物和乙醇提取物的利尿作用,然后进一步研究石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物和剩余提取物的利尿作用。给正常大鼠灌胃生理盐水（5 mL/100 g）,30 min后将大鼠随机分组,并分别给予上述药物,收集各组大鼠6 h内的尿液,测定尿量、尿液pH值以及电解质Na+、K+、Cl-的浓度。2.泽泻乙酸乙酯提取物首先采用MCI柱色谱进行初步分离,然后利用硅胶、RP-18、凝胶柱色谱及半制备高效液相色谱等技术进一步分离纯化,得到单体化合物。运用核磁共振波谱和质谱等方法解析化合物的结构。3.ABA的抗肾纤维化作用研究。首先,我们采用体内实验的方法评价ABA的抗肾纤维化作用。制作5/6肾切除（5/6 Nephrectomy,NX）和单侧输尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction,UUO）大鼠模型,用ABA对模型大鼠进行干预。实验结束时收集各组大鼠的24 h尿液、血液及肾组织样品。测定大鼠的体重、收缩压、血清肌酐、血清尿素、尿蛋白等生理生化指标。采用组织病理学技术分析大鼠肾组织的胶原沉积和形态学的变化。运用Western blot方法检测肾组织中α-SMA、collagen I、fibronectin等以及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达。其次,采用体外实验的方法进一步验证泽泻对肾脏细胞损伤的干预效应。以TGF-β1刺激的NRK-52E细胞为实验模型,利用Western blot、qRT-PCR等技术研究ABA对细胞中α-SMA、collagen I、fibronectin等蛋白以及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白表达的影响。运用免疫荧光染色、RNA干扰和免疫共沉淀等技术探究ABA抑制Smad3磷酸化的机制。4.四环三萜类新化合物25-O-甲基泽泻醇F（25-O-methylalisol F,MAF）的抗肾纤维化活性研究。以TGF-β1和Ang II刺激的NRK-52E细胞和NRK-49F细胞为实验模型,采用Western blot、qRT-PCR、免疫荧光染色等分子生物学技术首先评价MAF对collagen I、fibronectin、α-SMA、vimentin和E-cadherin等蛋白表达的影响,其次研究MAF对细胞中肾素-血管紧张素系统、TGF-β/Smad信号通路及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响。运用RNA干扰、免疫荧光染色和免疫共沉淀等技术研究MAF抑制Smad3磷酸化的机制。结果:1.泽泻具有利尿和抗利尿的双重作用。乙醇提取物在低剂量时具有利尿作用,而在高剂量时具有抗利尿作用。乙酸乙酯提取物具有类似的利尿和抗利尿作用,是泽泻利尿和抗利尿的活性部位。2.三萜类化合物是泽泻的主要化学成分。我们从泽泻的乙酸乙酯提取物中分离鉴定63个化合物:38个三萜、2个甾体、1个二萜、7个倍半萜、3个芳香族衍生物、2个生物碱、1个黄酮、1个呋喃衍生物及8个脂肪酸。分离到的三萜类化合物包括泽泻醇A、泽泻醇A-23-醋酸酯、泽泻醇A-24-醋酸酯、11-去氧泽泻醇A、25-O-甲基泽泻醇A、25-O-乙基泽泻醇A、泽泻醇B、ABA、11-去氧泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B-23-醋酸酯、16β-羟基泽泻醇B-23-醋酸酯、16β-甲氧基泽泻醇B-23-醋酸酯、16β-乙氧基泽泻醇B-23-醋酸酯、16-氧代泽泻醇A、16-氧代泽泻醇A-24-醋酸酯、泽泻醇C、泽泻醇C-23-醋酸酯、11-去氧泽泻醇C、11-去氧泽泻醇C-23-醋酸酯、16β-过氧氢泽泻醇B-23-醋酸酯、泽泻醇G、25-脱水泽泻醇A-11-醋酸酯、25-脱水泽泻醇A-24-醋酸酯、16-氧代-11-脱水泽泻醇A、泽泻醇L、泽泻醇L-23-醋酸酯、泽泻醇X、泽泻醇Y、16-氧代-11-脱水泽泻醇A-24-醋酸酯、alismanol A、alismanol B、alismanol C、alismanol E、25-O-甲基泽泻醇F、泽泻醇F、泽泻醇Z、25-脱水泽泻醇F、泽泻醇I;甾体类化合物包括β-谷甾醇和7-酮基胆甾醇;二萜类化合物为16（R）-（-）-kaurane-2,12-dione;倍半萜类化合物包括环氧泽泻醇烯、2β,4β,10α-trihydroxy-1αH,5βH-guaia-6-ene、泽泻萜醇A、泽泻萜醇B、泽泻萜醇C、泽泻萜醇E、泽泻醇;芳香族衍生物包括肉桂酸、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯;生物碱包括neochinulin A和11,14-dihydroxylneochinulin E;黄酮类化合物为橘皮素;呋喃衍生物为5-羟甲基呋喃醛;脂肪酸类化合物包括单硬脂酸甘油酯、亚油酸、棕榈酸-α,α’-双甘油酯、棕榈酸、棕榈酸甲酯、methyl（7E,9E）-6,11-dioxononadeca-7,9-dienoate、肉豆蔻酸、硬脂酸。其中,16β-乙氧基泽泻醇B-23-醋酸酯、泽泻醇Y、25-O-甲基泽泻醇F和泽泻醇Z为新化合物。3.ABA通过抑制NX和UUO介导的p-Smad3表达上调和Smad7表达下调而发挥抗肾纤维化作用。我们的研究表明ABA能显著地降低NX大鼠的收缩压、血清肌酐和尿素以及尿蛋白的水平,显著地下调NX和UUO大鼠肾组织中α-SMA、collagen I、fibronectin等蛋白的表达。进一步的研究结果显示ABA显著地下调NX和UUO大鼠肾组织中p-Smad3的表达而同时显著地上调Smad7的表达,但对其他Smad蛋白的表达无显著的影响。TGF-β1诱导的NRK-52E细胞实验进一步证明了这些结果。在siRNA Smad3转染的细胞中,ABA的抑制作用显著地减弱。本研究揭示ABA通过抑制TGFβRI与Smad3及SARA与Smad3之间的相互作用而促进TGFβRI与Smurf2、TGFβRI与Smad7及Smurf2与Smad7之间的相互作用抗肾纤维化。4.MAF通过调控RAS、TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin信号通路而抗肾纤维化。MAF显著地下调TGF-β1和Ang II刺激的NRK-52E细胞和NRK-49F细胞中collagen I、fibronectin、α-SMA等蛋白的表达,显著地下调血管紧张素原、肾素、ACE和AT1R的表达。MAF还能显著地下调p-Smad3的表达而上调Smad7的表达,但对其他Smad蛋白的表达无显著的影响。此外,MAF能显著地下调Wnt1和活化β-catenin以及其下游靶点蛋白Snail1、Twist、MMP-7、PAI-1和FSP1的表达。结论:本研究证明乙酸乙酯提取物是泽泻利尿和抗利尿的活性部位,三萜类化合物是泽泻的主要成分和活性成分。我们的研究发现三萜类化合物通过阻断RAS、下调p-Smad3而上调Smad7的表达及抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥抗肾纤维化作用。泽泻中三萜类化合物的抗肾纤维化活性及其机制研究进一步证明ABA作为指标成分被用于泽泻质量控制的重要性,也将为泽泻的开发应用提供实验依据和理论基础。