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迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)是危害水产养殖的病原菌之一,可引起多种类型的感染,致病机理复杂。由迟缓爱德华菌引起的疾病在世界海水、淡水养殖动物中普遍流行。化学药物是治疗迟缓爱德华菌感染的一种重要手段,但又会引起食品药物残留、细菌耐药性等问题。尽管预防迟缓爱德华菌感染的疫苗报道很多,但这些常用疫苗多是福尔马林(或热)灭活疫苗或亚单位疫苗,影响了细菌表面抗原的物理化学结构,影响了疫苗的免疫效果,而一些亚单位疫苗又缺少足够的免疫原性,常需加入免疫佐剂使用,而这些免疫佐剂有可能具有副作用。细菌菌蜕是通过调控噬菌体PhiX174的裂解基因E在革兰氏阴性细菌中表达而形成的无细胞浆和繁殖能力的细菌空壳,因其保持了细菌原有的细胞形态、细菌表面抗原性和黏附性等特性,即使象菌毛一样脆弱的结构也能被保护。同时,菌蜕包含LPS、类脂、肽聚糖等天然的免疫刺激复合物,无须使用佐剂。因此,菌蜕疫苗能诱导更强的免疫反应,是一种比常规疫苗更理想的新型疫苗体系。本研究首次在国内报道迟缓爱德华菌菌蜕疫苗的制备及应用。1迟缓爱德华菌制苗菌株的筛选通过形态学观察、选择性培养基筛选、生理生化分析、PCR鉴定及16S rDNA序列测定,证明本实验室保存的细菌为迟缓爱德华菌。应用PCR方法检测了迟缓爱德华菌的6个毒力基因在国内外分离株中的分布情况,并根据其溶血活性、对斑马鱼和小鼠的致病性研究,筛选出强毒株,为进一步后续研究奠定了基础。2迟缓爱德华菌菌蜕疫苗的制备本研究成功构建溶菌质粒载体,并将其转入迟缓爱德华菌真鲷分离株,通过温度诱导并跟踪检测其溶菌动力学过程,制备出迟缓爱德华菌菌蜕疫苗。扫描电镜和透射电镜观察,证实细菌结构未改变,且不含内容物。3以小鼠动物模型评价迟缓爱德华菌菌蜕疫苗的口服免疫效果分别用菌蜕疫苗(ETG)、福尔马林全菌灭活疫苗(FKC)和PBS口服免疫小鼠,并跟踪检测其体液免疫水平和细胞免疫水平的变化。结果表明,ETG免疫组血清IgA和IgG的抗体滴度与FKC和PBS免疫组相比,差异显著；ETG免疫组小鼠外周血淋巴细胞中CD3+／CD4+／CD8+阳性的百分率与FKC和PBS免疫组相比,差异显著。同源菌攻击试验表明,ETG、FKC和PBS组的相对保护率分别为86.7%(26／30),73.3%(22／30)和33.3%(10／30)。结果表明,ETG疫苗能诱导强烈的细胞免疫和体液免疫,提高免疫保护能力。4迟缓爱德华菌菌蜕疫苗对斑马鱼的免疫保护试验详细阐述研究斑马鱼白细胞吞噬活性的方法,并研究了迟缓爱德华菌蜕疫苗对斑马鱼白细胞吞噬活性的影响。试验表明,ETG免疫组的白细胞吞噬活性明显高于FKC和PBS免疫组,差异显著。攻击试验结果显示,ETG的免疫保护率高达83.3%(25／30)与FKC和PBS免疫组的70%(21／30)和6.7%(2／30)相比,差异显著。结果表明,ETG疫苗能有效地激活鱼类的免疫系统,产生免疫保护。5应用裂解基因和核酸酶基因共表达制备菌蜕疫苗葡萄球菌核酸酶A(SNA)对单链、双链DNA或RNA均具有较强的降解能力。成功构建表达葡萄球菌核酸酶A不同片段的质粒载体,通过诱导表达发现酶活性只与N’末端氨基酸序列有关,并发现编码SNA N’末端26个氨基酸的序列与λ噬菌体Cro基因融合表达可以降解细菌核酸,又可以被入噬菌体的cI857ts／PR调节系统调控。因此,利用这一技术成功构建调控噬菌体裂解基因和葡萄球菌核酸酶基因先后表达的质粒载体,制备出安全性更高的菌蜕疫苗。