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流感(Influenza)是由流行性感冒病毒(Influenza virus)感染引起的急性呼吸道传染病。流感病毒属于正粘病毒科,可感染人和多种动物。其中A型流感病毒对人类威胁最大,曾引起人类历史上4次流感大流行。A型流感病毒抗原性易发生变异,抗原的漂移和转换给流感的防治带来了较大困难。接种疫苗仍然是预防和控制流感的主要手段。目前使用的疫苗包括全病毒疫苗、裂解疫苗和减毒活疫苗。减毒活疫苗可通过鼻腔接种诱导局部的黏膜免疫应答和系统免疫应答,是流感疫苗发展的新方向。反向遗传学的快速发展,为开发流感病毒疫苗提供了新手段,1999年以后Neumann等、Hoffmann等分别建立了完全以质粒为基础的流感病毒反向遗传操作系统,在开发新型流感疫苗、快速制备疫苗候选株等方面显示了良好应用前景。本研究选择冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)(MDV-A)流感病毒株作为骨架病毒,运用8质粒系统拯救出冷适应减毒的A型人流感病毒,建立A型流感病毒冷适应拯救体系,并运用于06～07 A型流感病毒推荐疫苗组分株的拯救,为流感病毒新型疫苗的开发奠定了基础。1.MDV-A 6个内部骨架基因双向转录/表达重组质粒的构建与验证设计一对引物,以pcDNA3.1(+)质粒为模板扩增多聚A(polyA)信号序列,取代双向转录/表达载体pHW2000上牛生长激素(BGH)的多聚腺苷酸信号序列,构建双向转录/表达载体pAD3000。人工合成的MDV-A株6个内部基因片段,克隆至双向转录/表达载体pAD3000,构建6个polⅠ-polⅡ系统的转录/表达质粒,经测序验证6个内部基因片段均在设计位点引入突变,期望6个质粒通过同一个载体,转染后利用细胞中的polⅠ和polⅡRNA聚合酶,实现MDV-A 6个内部基因vRNA和mRNA的转录和表达。用MDV-A任意一个内部基因重组质粒与A/PR/8/34的基因组合,即7+1组合形式共转染COS-1细胞,37℃或33℃、5%CO2培养48h后将转染上清液接种10日龄SPF鸡胚,96h后检测鸡胚尿囊液血凝效价。实验结果表明,6种组合均能产生有血凝性的流感病毒,说明双向转录/表达载体pAD3000能正常工作,含有MDV-A 6个内部基因片段的质粒,在同一载体上实现了vRNA和mRNA的转录和表达,并能装配成病毒,为下一步拯救MDV-A冷适应骨架病毒毒株打下了基础。2冷适应减毒重配A型流感病毒rMDV-A的拯救及部分生物学特性的鉴定用MDV-A 6个内部基因质粒与A/PR/8/34的表面HA和NA基因质粒组合,共转染COS-1细胞,33℃、5%CO2培养48 h,转染上清液接种10日龄SPF鸡胚,96h后检测鸡胚尿囊液血凝效价,得到有血凝性的重组A型流感病毒rMDV-A,电镜形态观察rMDV-A,与野生型流感病毒相似。rMDV-A在鸡胚中传至4代后,收集尿囊液,RT-PCR扩增6个内部基因片段,测序,序列分析与MDV-A 6个内部基因片段序列一致,说明rMDV-A能在鸡胚中稳定增殖。rMDV-A在不加胰酶的情况下感染MDCK细胞,能引起细胞变圆、脱落等病变。收集PR8和rMDV-A病毒在33℃、37℃、38℃和39℃四个温度培养的鸡胚尿囊液,测定两种病毒在MDCK细胞上空斑形成单位(PFU),结果表明rMDV-A效价随着温度的升高有明显下降趋势。到39℃时,病毒效价急剧下降,可见rMDV-A对温度敏感,较低温度(如33℃)更适于rMDV-A病毒的繁殖。rMDV-A的拯救和鉴定,说明成功建立了A型流感病毒冷适应减毒株拯救体系,为开发A型流感病毒减毒疫苗奠定了基础。3.06～07 A型流感病毒冷适应候选疫苗株的拯救RT-PCR扩增06～07 A型流感病毒推荐疫苗组分株A/New Caledonia/20/99(H1N1)和A/Wisconsin/67/2005(H3N2)的HA和NA基因,连接pGEM-T载体并测序,得到序列正确的HA和NA基因,并克隆至双向转录/表达载体pAD3000上,分别与MDV-A 6个内部基因共转染COS-1细胞,33℃、5%CO2培养48 h,转染上清液接种10日龄SPF鸡胚,96h后检测鸡胚尿囊液血凝效价,得到有血凝性的重组A型流感病毒rMDV-A-H1,rMDV-A-H3,拯救出06～07 A型流感病毒冷适应候选疫苗株,为06～07流感病毒减毒三价疫苗的开发与生产奠定基础。本研究运用8质粒拯救系统建立了A型流感病毒冷适应拯救体系,为流感病毒新型疫苗的开发提供了新的手段。