在代谢工程研究中,提高限速酶的表达以增加目标化合物合成途径的代谢流,同时精细调节各个旁路基因的表达,使其满足细胞生长所需又最大化降低代谢分流,是提高目标化合物产量的不二法则。此外,建立目标化合物生物感应系统进行高通量筛选,将大幅提高突变体库的筛选效率,对于目标化合物高产菌株的构建具有重要的价值。本研究以枯草芽孢杆菌SCK6为宿主,围绕上述三个方面开展研究,主要研究结果如下:1.建立枯草杆菌高效遗传转化系统。系统分析了培养基营养成分、感受态关键调节因子ComK的表达水平、宿主限制修饰系统和抗生素选择标记对枯草杆菌SCK6感受态细胞效率的影响,得到的最优条件为:YN培养基培养细胞,以1.5%的木糖浓度诱导ComK的表达,使用非甲基化的质粒和以SPC作为抗生素选择标记。与文献报道方法相比,使SCK6感受态效率提高了 2个数量级。2.建立新的启动子文库构建方法和筛选基因特异性强启动子。我们建立了一种基于寡核苷酸退火的启动子改组方法,该方法以启动子保守序列（-35区和-10区）为节点,使不同启动子进行随机组合,得到组合启动子文库。首先,以GFP为报告基因,选取四个不同强度的出发启动子,通过上述方法直接在枯草杆菌SCK6中构建了启动子文库,从中筛选到11个比目前报道的强启动子P43活性更高的启动子,最强的启动子转录强度是P43的9倍。然而,我们从文库中选择不同强度的组合启动子表达木聚糖酶XynHB和普鲁兰酶Pul703时,发现启动子强度与XynHB和Pu1703的表达量不成对应关系,暗示启动子的强度与所表达的基因之间具有一定的依赖性。为了在枯草杆菌中高效表达商品化淀粉酶BLA,我们构建了 BLA特异性启动子文库,并增加了两个出发启动子序列,及将-10区保守区域设计为TAWWAT,以增加文库片段的多样性。同时,我们建立了CRISPR辅助的转化体系,利用CRISPR/Cas9在整合位点处引入双链DNA断裂,提高文库片段和染色体间的重组效率,从而提高文库片段的转化效率。文库表征得到21个活性远高于P43的启动子序列,最强的启动子P525的转录强度是最弱的启动子P232的6倍以上。3.枯草杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统和NHEJ途径重构。我们在枯草杆菌中构建了 CRISPR/Cas9系统,以内源基因AmyE和外源整合抗性基因EmR作为靶基因进行验证,发现CRISPR/Cas9在枯草杆菌中的基因编辑效率接近100%。由于枯草杆菌营养细胞不能通过NHEJ途径修复DNA双链断裂,我们首先在枯草杆菌营养细胞中重构芽孢特异性表达的NHEJ途径,但是发现它不能工作。随后,又在枯草杆菌营养细胞中构建了来源于耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌的NHEJ途径,通过CRISPR/Cas9引入DSB,在不提供同源修复模板的情况下,得到20多个转化子,然而测序结果显示所有转化子的靶基因均未发生任何突变。4.基于CRISPR的多向性转录调节工具。将dCas9分别与枯草杆菌RNA聚合酶的α亚基和ω亚基融合表达,以P43-GFP表达单元为报告系统,当向导RNA靶向GFP上游距离起始密码子305-459bp时,dCas9-ω/α都能有效促进GFP的表达,其中,当距离为327bp时,dCas9-ω使GFP的表达量提高了 3.3倍。随着距离的增加或减少,dCas9-ω/α的转录促进作用均减弱,当dCas9-α/ω与启动子-35区结合时,GFP的的相对荧光强度与对照相近。而当dCas9-ω/α和RBS区或基因编码区结合时,可显著抑制GFP的表达,最好的抑制效应使GFP的表达几乎被完全抑制。说明dCas9-ω/α对基因的转录调节具有位置效应,因此,通过设计与靶基因不同区域配对的向导RNA,即可实现同时促进和抑制不同基因的表达。为了分析dCas9-ω能否促进内源基因的表达,我们以AmyE作为靶基因,通过设计向导RNA引导dCas9-ω结合到AmyE起始密码子上游224 bp,使AmyE的表达量提高了 3倍。而针对同一个基因设计两个向导RNA或将dCas9与α和ω融合表达（dCas9-α-ω或dCas9-ω-α）,都不能进一步提高靶基因的表达。5.利用dCas9-ω调节蛋白质量控制体系精细调节基因表达。利用dCas9-ω的多向性基因转录调节能力,设计向导RNAs使dCas9-ω分别抑制枯草杆菌胞外蛋白酶的表达和促进分子伴侣的表达,发现靶向蛋白酶nprB,bpr和vpr时BLA的表达量明显提高,相对酶活分别提高了 100%,45%和60%,说明这三个蛋白酶对BLA有明显的降解活性。利用dCas9-ω提高胞外分子伴侣PrsA的表达时,BLA的相对酶活提高了 73%。而降低蛋白酶mpr、epr和wprA或提高胞内分子伴侣groES都对BLA的表达没有明显影响。6.建立基于RFN元件的核黄素传感器。为了建立核黄素高产菌株的高通量筛选方法,我们基于RFN元件构建了核黄素传感器,即使用FMN核糖开关调节lacI的表达,同时使用lacO调节GFP的表达,从而使GFP的表达受FMN的调控,且GFP的表达量与胞内FMN的浓度呈正相关。然而,在培养基中添加配体FMN,发现传感器的应答效能很差,GFP的荧光强度最高仅提高了 35%。通过不同启动子调节lacI的表达,并不能提高传感器对培养基中FMN的应答效能,推测胞外添加的配体不能有效转运到胞内是传感器效能差的主要原因。随后,我们在枯草杆菌中过表达核黄素转运蛋白YpaA,发现传感器的应答效能显著提高。当外源添加的核黄素达到150μM时,GFP的相对荧光强度与对照（不加核黄素）相比提高了 2倍,当核黄素浓度增加到2mM时,GFP的相对荧光强度提高了3倍以上。而当核黄素浓度达到4 mM和8 mM时,胞内FMN浓度提高,作用于胞内的核黄素合成途径的RFN元件,抑制细胞的生长。7.偶联胞内核黄素浓度与细胞生长速率。由于高产菌株代谢负担大,在传代培养中容易被低产突变体取代,我们尝试将核黄素产量和细胞的生长速率偶联起来。我们先将枯草杆菌的ylaN基因敲除,使细胞在不含FeC13的LB培养基中生长,随后将传感器中的GFP替换为ylaN,通过核黄素的产量调控ylaN的表达,当细胞中核黄素含量高时,ylaN的表达量提高,使菌株在LB培养基中能正常生长,从而将高产菌株筛选出来,并使其在传代过程中被保留下来。