抑郁症的核心症状是情绪低落、快感缺乏、易怒、难以集中注意力、食欲和睡眠异常等,具有极高的发病率和致死致残率,为家庭和社会带来了极大的精神和经济负担。为了对抑郁症进行有效的预防和治疗,必须对抑郁症的发生和发展过程进行彻底的了解。然而,目前抑郁症因其致病因素复杂、病因不清、发病机制不详,一直是神经科学领域的一大难题。现有研究结果表明,生物活性分子包括神经递质、相应的合成或水解酶、活性氧自由基（ROS）、活性氮自由基（RNS）、金属离子等,在抑郁症的发生发展过程中发挥至关重要作用。因此,探讨神经细胞信号通路对小鼠抑郁行为的影响,尤其是分析神经递质等生物活性分子的种类和浓度变化对神经元功能以及小鼠抑郁行为的调控作用,对揭示抑郁症的发生发展机制以及诊疗研究显得尤为重要。目前,荧光成像技术具有分辨率高、损伤小、操作简便等明显优势,广泛用于活细胞及活体内生物活性分子的实时原位准确检测。尤其是双光子荧光成像的方法,由于采用长波长激发,具有背景荧光干扰小、组织穿透深、光损伤小等显著优势,更加适用于活体原位可视化分析。然而迄今为止,能够高选择性识别脑神经元内抑郁症相关活性分子的荧光探针还很少,尤其是双光子荧光探针少见报导。小分子荧光探针具有稳定的性能、易于透过血脑屏障、操作相对简便、生物相容性好等优势,是用于活体双光子脑部成像抑郁症相关活性分子的理想工具。因此,为了利用双光子荧光成像技术精准检测活体脑内神经元中抑郁症相关生物活性分子,探究相关信号通路,亟需发展理想的有机小分子双光子荧光探针。基于以上原因,本论文针对目前检测活体脑内神经元中抑郁症相关生物活性分子所面临的瓶颈问题,发展了一系列性质稳定、生物相容性良好、应答快速的有机小分子荧光探针,实现了对活体脑内神经元细胞中ROS（羟基自由基、超氧阴离子自由基）、神经递质水解酶（乙酰胆碱酯酶）、金属离子（锌离子）的高灵敏度、特异性双光子荧光成像分析,系统研究了小鼠活体脑部抑郁症相关生物活性分子的变化,并初步探讨了活性分子参与的相关信号通路,为揭示抑郁症发生发展的相关分子机制研究提供重要信息和理想的成像探针。本论文主要内容如下:1、设计合成了一个用于活体脑部成像乙酰胆碱酯酶的双光子荧光探针MCYN。该探针能够快速、高选择性地监测乙酰胆碱酯酶的活性变化。利用双光子成像技术,首次在活体水平用荧光成像方法观察到了抑郁小鼠模型大脑中的乙酰胆碱酯酶活性的升高。此外,借助一个O₂^·-的双光子荧光探针,首次在活体小鼠脑内揭示了乙酰胆碱酯酶与O₂^·-水平的协同变化。研究结果指出可能是氧化应激导致了乙酰胆碱酯活性的增加从而导致了小鼠抑郁行为的加重,为深入揭示氧化应激在抑郁症发生发展过程中的病理学作用提供了新策略和新思路。2、设计合成了一个高选择性、高灵敏度成像小鼠大脑中·OH的双光子荧光探针MD-B。基于特异性的单电子氧化反应,该探针可以瞬时、高灵敏、高选择性地识别·OH。利用双光子成像技术,MD-B可以应用于成像高浓度谷氨酸刺激下神经胶质细胞中·OH的爆发。探针中引入的三氟甲基基团大大增加了探针的脂溶性,有助于通过血脑屏障,从而实现活体大脑中·OH的荧光成像。成像结果表明抑郁小鼠脑部·OH浓度升高。利用蛋白质组学分析,进一步证明过量产生的·OH可以导致SIRT1的失活从而导致抑郁行为的加重。这一工作为探究抑郁症相关的分子机制和抗抑郁治疗提供了新工具。3、设计合成了一个同时检测Zn²⁺和O₂^·-的双光子荧光探针,在单光子400 nm或双光子800 nm激发下,探针与Zn²⁺反应后,560 nm处荧光明显增强,而与O₂^·-反应后,480 nm处荧光明显增强。基于同一激发,两处发射光谱可区分,有利于进行双色成像。该探针对Zn²⁺和O₂^·-的识别具有高选择性,且荧光信号互不干扰。细胞成像结果表明,在高浓度的谷氨酸诱导的氧化应激状态下细胞内Zn²⁺和O₂^·-同时升高。重要的是,利用检测SIRT1活性的探针,观察到了Zn²⁺和O₂^·-同时升高伴随着SIRT1活性的降低。该工作进一步揭示了在抑郁症的发生发展过程中活性氧对SIRT1的调控作用。4、设计合成了靶向线粒体定量检测·OH的双光子荧光探针,通过引入带有正电荷的脂溶性三苯基膦结构,该探针可以精确检测线粒体中·OH的变化。在单光子400 nm或双光子800 nm激发下,探针的荧光发射在450 nm,与·OH反应后,探针结构的ICT效应增强,450 nm处荧光降低,560 nm处荧光明显增强,从而实现了对·OH的比率检测。细胞共定位实验表明,探针具有优异的线粒体定位能力。更重要的是,该探针能够对活体小鼠大脑中线粒体内的·OH进行定量可视化分析。此外,结合SIRT3 Elisa试剂盒分析结果,进一步揭示了氧化应激过程中线粒体内产生的过量·OH可能通过抑制SIRT3的活性,最终导致抑郁行为的加重。该工作进一步揭示了抑郁症的发生发展过程中ROS参与的分子机制。