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豆科植物与根瘤菌共生的建立起始于两者间的信号分子交流。对于根瘤菌和豆科植物的共生而言,宿主的类黄酮诱导根瘤菌合成结瘤因子是植物早期共生反应所必需的。豆科植物释放到根际的类黄酮被相应的根瘤菌NodD蛋白识别后,激活根瘤菌nod基因的表达,从而合成结瘤因子。结瘤因子被豆科植物的结瘤因子受体,比如百脉根的NFR1和NFR5识别,激活植物体内的共生信号通路,并引起侵入线的形成和根瘤器官的发生。尽管NFR5已经研究了15年,但它调节根瘤菌侵染和共生结瘤的机制仍然存在许多的未知。在本研究中,我们利用酵母双杂交技术,鉴定出一个类二氢黄酮醇还原酶(LjDFL1),它与NFR5相互作用,并正调控根瘤菌的侵染。主要研究结果如下:1.以百脉根NFR5的蛋白激酶结构域(LjNFR5-KD)为诱饵,筛选百脉根ADcDNA酵母双杂交文库,获得一个编码类二氢黄酮醇还原酶的基因(LjDFL1)。通过酵母双杂交实验、体外蛋白Pull-down实验、免疫共沉淀(Co-IP)实验、双分子荧光互补(BiFC)实验证明LjDFL1和LjNFR5有相互作用,并且LjNFR5、LjDFL1同源蛋白的相互作用在豆科植物中具有保守性。2.通过qRT-PCR分析,LjDFL1基因在各组织中均有表达,但在根中的表达量最高。LjDFL1启动子的组织化学染色分析显示,LjDFL1启动子在根尖,尤其在靠近根尖的根毛、分生区和成熟区的根表皮细胞中,有很强的活性。说明LjDFL1基因在根的敏感区表达量高。3.通过qRT-PCR分析,在接种根瘤菌或用结瘤因子处理的根中,LjDFL1的mRNA丰度显著下降。接种根瘤菌后,百脉根早期共生基因突变体nfr5,symrk,ccamk,nsp2和nin根中LjDFL1基因的表达量没有明显下调。在接种根瘤菌nodB或nodC突变体的根中,LjDFL1基因的表达量明显高于接种野生型根瘤菌的表达量。说明激活的共生信号通路可以负反馈调节LjDFL1基因的表达。4.通过CRISPR/Cas9技术和百脉根稳定转化技术,获得百脉根LjDFL1敲除突变体ljdfl1-1和ljdfl1-2。接种带lacZ标记基因的根瘤菌5 d后,ljdfl1-1和ljdfl1-2突变体的平均侵入线数和侵入线密度显著低于对照。qRT-PCR分析结果显示,ljdfl1突变体中NIN,NPL,NF-YA1和EPR3在mRNA水平上的表达量比对照的低。说明LjDFL1的功能缺失后导致侵染过程中侵入线数减少。5.通过百脉根稳定转化技术,获得LjUbq1启动子驱动的LjDFL1超表达稳定转化植株LjDFL1-OX-2和LjDFL1-OX-8。LjDFL1-OX-2和LjDFL1-OX-8根中LjDFL1的表达量分别是对照的29、38倍。接种带lacZ标记基因的根瘤菌5 d后,超表达植株平均侵入线数和侵入线密度显著高于对照。基因表达分析表明,超表达植株NIN,NPL,NF-YA1和EPR3的mRNA丰度显著高于对照。说明超表达LjDFL1基因促进百脉根侵入线的形成。