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背景与目的肝肺综合征（hepatopulmonary syndrome, HPS）是在慢性肝病和/或门脉高压的基础上出现肺内微血管异常扩张、气体交换障碍、动脉血氧合作用异常而导致的一种综合病征,在肝硬化患者中发病率可达15%,也是引起移植围术期移植肝无功能及肺部感染的主要原因。尽管HPS的研究逐渐成为研究热点,但其发生发展机制仍不明确,Sindhu等认为以肺内分流为主的血液分流是HPS的主要病因,其中肺内微血管扩张是肺内功能性分流的形态学基础。通过增强-对比超声检查、99m锝-多聚蛋白肺灌注显像、肺血管造影等方法均可证实HPS患者肺内血管床在前毛细血管和毛细血管水平存在广泛扩张,即发生显著性的肺微血管扩张（Pulmonary vaso dilatation, PVD）。由于肺微血管主要构成细胞为肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）,因此显著性肺微血管扩张（扩张直径可达20-50μm）只能由PMVECs异常增殖完成。由此,目前绝大多数学者认为PMVECs异常增殖致使微血管扩张,扩张的微血管导致血红蛋白氧合困难产生难治性低氧血症和低氧肺血管重建（肺平滑肌细胞的异常增殖导致肺动脉壁增厚）而进一步加重低氧血症,从而导致HPS的发生和进展。虽然HPS微血管扩张的机制尚不明确,但比较一致的意见认为:众多的肝源性细胞因子通过血液循环作用于PMVECs后都促使其发生了增殖反应。由于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt（serine/ threonine kinase,Akt）处于多条信号通路的重要交叉点,可调节细胞因子、生长因子等细胞生存信号,普遍存在于真核生物的调控网络中,与多种增生增殖疾病的发生发展密切相关。研究发现,抑制Akt相关通路后,对其他信号通路引发的细胞增殖现象有一定的抑制作用。基于以上理由,我们推测在慢性肝病和/或门脉高压的基础上,血清中众多的肝源性细胞因子作用于Akt家族,使PMVECs异常增殖,进而发生显著性的肺微血管扩张,导致HPS的发生发展,这正是本研究立题的目的所在。本研究采用建立HPS大鼠模型、培养PMVECs、MTT、3H-TdR掺入实验、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）、蛋白印记（Western Blot）等技术和方法,通过HPS大鼠血清培养PMVECs,检测PMVECs增殖情况、Akt家族（Akt1, Akt2, Akt3）的表达水平变化,探讨HPS发生的原因和可能机制。方法实验分三部分:1.建立HPS大鼠模型,提取血清采用的慢性胆管结扎法制备HPS大鼠模型,并鉴定。提取血清。2.PMVECs的培养以及增殖检测取正常大鼠,原代培养、纯化及鉴定PMVECs。PMVECs随机分为2组:对照组（C组）和HPS干预组（HPS组）,孵育24、48和72 h（T1～3）,采用MTT法和3H-TdR掺入法检测PMVECs增殖能力。3.Akt家族的mRNA以及蛋白表达的检测两组PMVECs孵育24、48和72 h后采用RT-PCR法和Western blot法分别检测Akt1 mRNA、Akt2 mRNA和Akt3 mRNA及其蛋白的表达。结果1.HPS大鼠血清对PMVECs增殖的影响与C组比较,HPS组PMVECs增殖能力增强（P<0.05）;HPS组中,随着培养时间的增加,PMVECs增殖能力增加,与T1时比较,T2,T3时HPS组PMVECs增殖能力增强（P<0.05）,与T2时比较,T3时HPS组PMVECs增殖能力增强（P<0.05）。2.Akt家族的mRNA表达的检测采用RT-PCR法检测Akt1 mRNA、Akt2 mRNA和Akt3 mRNA,结果显示:与C组比较,HPS组PMVECs Akt mRNA表达水平升高（P<0.05）;HPS组中,随着培养时间的增加,PMVECs Akt mRNA表达增强,与T1时比较,T2,T3时HPS组PMVECs Akt mRNA表达水平升高（P<0.05）,与T2时比较,T3时HPS组PMVECs Akt mRNA表达增强（P<0.05）。3.Akt家族的蛋白表达的检测采用RT-PCR法检测Akt1蛋白、Akt2蛋白和Akt3蛋白,结果显示:与C组比较,HPS组PMVECs Akt蛋白表达增强（P<0.05）;HPS组中,随着培养时间的增加,PMVECs Akt蛋白表达增强,与T1时比较,T2,T3时HPS组PMVECs Akt蛋白表达增强（P<0.05）,与T2时比较,T3时HPS组PMVECs Akt蛋白表达增强（P<0.05）。结论1.在HPS大鼠血清诱导下,PMVECs增殖能力增强,提示HPS大鼠血清可通过某种途径导致HPS发生发展过程中PMVECs的增殖。2.随着时间的延长,HPS大鼠血清诱导的PMVECs中Akt家族蛋白及其mRNA表达增强,表明在HPS血清诱导的PMVECs的增殖能力增强与Akt家族的表达水平升高有关,Akt参与的信号途径可能是调节PMVECs增殖的重要途径,在HPS发生发展过程中起重要作用。