第一部分前瞻性ART母婴安全性流行病学调查目的：开展大样本前瞻性ART母婴安全性流行病学调查,比较分析ARTCIVF和ICSI)新鲜胚胎移植后的受孕者、自然受孕者两组人群妊娠结局各指标的差异,以期为评估我国ART技术安全性评估提供新的依据。研究对象和方法：以ART (IVF和ICSI)新鲜胚胎移植后的受孕者为观察组,以自然受孕人群为对照,采用前瞻性队列研究的方式,收集ART组和对照组受孕、妊娠以及新生儿出生的信息,比较分析两组人群妊娠结局各指标的差异。前瞻性队列研究的人群选择：(1)ART组人群选择：2009年-2013年在浙江大学医学院附属妇产科医院接受IVF和ICSI治疗,行新鲜胚胎移植,并获得妊娠者。(2)对照组人群选择：同期浙江大学医学院附属妇产科医院门诊就诊,停经40天之内,尿hCG检验阳性,愿意维持妊娠的自然受孕者。研究内容：(1)受试者一般情况：包括年龄、教育背景、既往不良孕产史(流产和异位妊娠)、既往妇科疾病史(盆腔炎性疾病和子宫内膜异位症史)等。(2)生化妊娠：单纯血或尿β-hCG升高,B超检查未见妊娠囊。(3)早期临床妊娠：妊娠在12周之内,血或尿β-hCG升高,B超检查见妊娠囊。(4)流产：妊娠不足28周,胎儿体重不足1000g而妊娠终止者。包括难免流产、稽留流产等。本研究中不包括非医疗性的人工流产。(5)早期流产：发生在妊娠12周之内的流产,称为早期流产。(6)晚期流产：发生在妊娠第13周或之后的流产,称为晚期流产。(7)异位妊娠：胚胎在子宫体腔以外着床,包括：输卵管妊娠、卵巢妊娠、腹腔妊娠、宫颈妊娠、子宫残角妊娠等。(8)宫内外妊娠：胚胎同时在子宫体腔和子宫体腔以外着床。(9)葡萄胎：妊娠后胎盘绒毛滋养细胞增生、间质水肿、形成大小不一的水泡,水泡间借蒂相连成串,形如葡萄而名之。(10)早产：妊娠满28周至不满37足周间分娩者。(11)死胎、死产：妊娠20周后,胎儿在子宫内死亡者称死胎,胎儿在分娩过程中死亡称死产,死产是死胎的一种。(12)新生儿出生缺陷：新生儿出生后身体结构异常。包括头面部、躯干、四肢、神经系统、循环系统、呼吸、消化、泌尿、生殖系统等结构异常。3.调查方式和调查终点：(1)调查方式：电话问卷调查,门诊问卷调查,QQ、微信、邮件等通讯工具反馈,临床检测,住院记录查阅等。(2)随访时间与次数①初次调查：完成表格一般项目等的填写(ART组从胚胎移植后14天内血hCG阳性开始；对照组从初次来医院就诊,尿hCG阳性开始)；②妊娠12周联系询问是否有早期流产、异位妊娠等；③妊娠28周确定有无引产、晚期流产等；④妊娠36周以后每2周联系询问一次,至分娩。(3)调查终点：ART组、对照组出现流产、异位妊娠、葡萄胎、死产、死胎、早产、活产时,调查结束。统计学方法数据主要分析内容包括描述性统计、t检验、χ2检验,如果不符合χ2检验的条件,使用Fisher确切概率法。采用SPSS21.0统计软件进行分析,结果用均值(mean)及标准差(SD)表示,p<0.05时认为差异存在统计学意义。结果：(1)ART组与对照组一般情况比较2009年-2013年在浙江大学医学院附属妇产科医院接受ART (IVF和ICSI)治疗,行新鲜胚胎移植,共受孕6361例,失访31例,完成随访6330例,随访率99.51%。调查同期对照组人群6019例,其中愿意参与调查者5471例,拒绝548例。调查人群合作率90.89%。5471例中,失访553例,共完成随访4918例,随访率89.89%。ART组与对照组年龄比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组年龄分别为30.89±4.09、30.48±4.30,30.74±4.13和27.61±3.25。IVF-对照组、ICSI-对照组、ART-对照组、IVF-ICSI组差异均有统计学意义p<0.01)(表1-1)。ART组与对照组教育程度比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组初中以下学历分别占42.18%、38.43%,41.20%和14.35%。IVF-对照组、ICSI-对照组、ART-对照组、IVF-ICSI组差异均有统计学意义(p<0.01)(表1-1)。(2)ART组与对照组既往病史比较ART组与对照组既往流产发生率比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组既往流产发生率分别为52.33%、38.98%、48.86%和33.16%。IVF-对照组、ICSI-对照组、ART-对照组、IVF-ICSI组差异均有统计学意义(p<0.01)(表1-2)。ART组与对照组既往异位妊娠发生率比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组既往异位妊娠发生率分别为19.03%、6.27%、15.64%和1.36%。IVF-对照组、ICSI-对照组、ART-对照组、IVF-ICSI组差异均有统计学意义(p<0.01)(表1-2)。ART组与对照组既往盆腔炎性疾病发生率比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组既往盆腔炎性疾病发生率分别为34.02%、18.39%、29.97%和2.54%。IVF-对照组、ICSI-对照组、ART-对照组、IVF-ICSI组差异均有统计学意义(p<0.01)(表1-2)。ART组与对照组既往子宫内膜异位症发生率比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组既往子宫内膜异位症发生率分别为8.36%、4.08%、7.25%和0.75%。IVF-对照组、ICSI-对照组、ART-对照组、IVF-ICSI组差异均有统计学意义(p<0.01)(表1-2)。(3)ART组与对照组随访结局比较ART组与对照组总体情况比较ART组异位妊娠发生率：5.59%；宫内外妊娠率0.95%；早期流产率17.75%；早期临床妊娠流产率：13.48%；晚期流产率2.51%(表1-3)。对照组异位妊娠发生率：1.09%；宫内外妊娠率0.00%；早期流产率10.36%；早期临床妊娠流产率：9.32%；晚期流产率3.14%(表1-4)。注1：异位妊娠发生率=(异位妊娠人数+宫内外妊娠人数)/(随访人数-生化妊娠人数)。注2：宫内外妊娠率=宫内外妊娠人数/(随访人数-生化妊娠人数)。注3：流产率=(流产+生化妊娠+28周内终止的宫内外妊娠人数)/(随访人数-异位妊娠人数-主观原因终止妊娠人数)。注4：早期临床妊娠流产率=(流产+28周内终止的宫内外妊娠人数)/(随访人数-异位妊娠人数-生化妊娠人数)。注5：生化妊娠率=生化妊娠人数/(随访人数-异位妊娠人数-宫内外妊娠人数)。ART组与对照组总体流产率比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组流产率分别为19.64%、20.33%、19.82%和13.19%。IVF组,、ICSI组、ART组流产率均高于对照组,差异有统计学意义p<0.01)。IVF组流产率低于ICSI组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-5)。ART组与对照组早期流产率比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组早期流产率分别为17.71%、17.87%、17.75%和10.36%。IVF组、ICSI组、ART组早期流产率均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。IVF组早期流产率低于ICSI组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-5)。ART组与对照组生化妊娠率比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组生化妊娠率分别为4.87%、5.32%、4.99%和0.99%。IVF组、ICSI组、ART组生化妊娠率均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。IVF组生化妊娠率低于ICSI组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-5)。ART组与对照组早期临床妊娠流产率比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组早期临床妊娠流产率分别为13.54%、13.29%、13.48%和9.32%。IVF组、ICSI组、ART组早期临床妊娠流产率均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。IVF组早期临床妊娠流产率高于ICSI组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-5)。ART组与对照组异位妊娠率比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组异位妊娠率分别为6.10%、4.11%、5.59%和1.09%。IVF组、ICSI组、ART组异位妊娠率均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。IVF组异位妊娠率高于ICSI组,差异有统计学意义(p<0.01)(表1-5)。ART组与对照组晚期流产率比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组晚期流产率分别为2.34%、2.99%、2.51%和3.14%。IVF组晚期流产率低于ICSI组,差异无统计学意义(p>0.05)。IVF组晚期流产率低于对照组,差异有统计学意义(p<00.05)。ICSI组、ART组晚期流产率低于对照组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-5)。ART组与对照组胎数比较ART组分娩共4850例,其中单胎3547例,占73.13%,双胎1298例,占26.76%,三胎5例,占0.10%。对照组分娩共4161例,其中单胎4111例,占98.80%,双胎49例,占1.18%,三胎1例,占0.02%。IVF组、ICSI组、ART组双胎率、多胎率高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。IVF组双胎率、多胎率高于ICSI组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-6)。ART组与对照组总体早产率比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组早产率分别为20.25%、17.79%、19.61%和5.09%。IVF组、ICSI组、ART组早产率均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。IVF组早产率高于ICSI组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-7)。ART组与对照组单胎早产率比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组单胎早产率分别为9.01%、7.79%、8.68%和4.62%。IVF组、ICSI组、ART组单胎早产率均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。IVF组单胎早产率高于ICSI组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-7)。ART组与对照组多胎早产率比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组多胎早产率分别为49.80%、47.94%、49.35%和44.00%。IVF组、ICSI组、ART组多胎早产率均高于对照组,差异无统计学意义(p>0.05)。IVF组多胎早产率高于ICSI组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-7)。ART组与对照组总体分娩方式比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组总体剖宫产率分别为82.06%、78.18%、81.05%和51.96%。IVF组、ICSI组、ART组总体剖宫产率均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。IVF组总体剖宫产率高于ICSI组,差异有统计学意义(p<0.01)(表1-8)。ART组与对照组单胎分娩方式比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组单胎剖宫产率分别为76.93%、72.74%、75.81%和51.54%。IVF组、ICSI组、ART组单胎剖宫产率均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。IVF组单胎剖宫产率高于ICSI组,差异有统计学意义p<0.05)(表1-8)。3.2.3.3.2 ART组与对照组多胎分娩方式比较IVF组ICSI组、ART组及对照组多胎剖宫产率分别为95.55%、94.60%、95.32%和86.00%。IVF组、ART组多胎剖宫产率高于对照组,差异有统计学意义p<0.01)。ICSI组多胎剖宫产率高于对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。IVF组多胎剖宫产率高于ICSI组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-8)。ART组与对照组新生儿性别比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组新生儿男女性别比分别为1.05、1.03、1.05和1.03。各组间差异均无统计学意义(p>0.05)(表1-9)。ART组与对照组总体新生儿出生体重比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组低体重新生儿率分别为21.93%、21.77%、21.89%和7.19%。IVF组、ICSI组、ART组低体重新生儿率均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。IVF组低体重新生儿率高于ICSI组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-10)。ART组与对照组单胎新生儿出生体重比较IVF组、CSI组、ART组及对照组单胎低体重新生儿率分别为5.78%、5.89%、5.81%和5.98%。IVF组、ICSI组、ART组单胎低体重新生儿率均低于对照组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-10)。ART组与对照组单胎足月新生儿出生体重比较IVF组、ICSI组、ART组及对照组单胎足月低体重新生儿率分别为4.62%、4.67%、4.63%和4.82%。IVF组、ICSI组、ART组单胎足月低体重新生儿率均低于对照组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-10)。ART组与对照组多胎新生儿出生体重比较IVF组、CSI组、ART组及对照组多胎低体重新生儿率分别为43.12%、45.85%、43.78%和58.51%。IVF组、ART组多胎低体重新生儿率低于对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。ICSI组多胎低体重新生儿率低于对照组,差异无统计学意义(p>0.05)。IVF组多胎低体重新生儿率低于ICSI组,差异无统计学意义(p>0.05)(表1-10)。结论：按照前瞻性队列研究的方式,以ART (IVF和ICSI)新鲜胚胎移植后的受孕者为观察组,以自然受孕人群为对照进行设计,11248例流行病学调查结果显示ART组的流产率、异位妊娠率、多胎率、早产率、剖宫产率、低出生体重儿发生率等多项指标高于对照组,应引起临床重视。ART远期和跨代安全性值得进一步的研究。第二部分IVF-ET F2代小鼠脑组织DNA甲基化修饰的改变研究目的：研究经过IVF-ET过程出生的F2代小鼠脑组织非印记基因DNA甲基化修饰的改变,以及这些改变在3周龄断乳期到10周龄成年期小鼠脑组织中的连续变化过程,为IVF-ET跨代安全性评估提供新的依据。材料和方法：C57BL/6J系雌鼠经过超促排卵,获得成熟期Ⅱ的卵子,与C57BL/6J系雄鼠精子体外受精后,胚胎移植至ICR假孕雌性小鼠的输卵管内,获得IVF F1代小鼠。然后这些IVF F1代小鼠分别与IVF F1代小鼠/普通小鼠合笼,分别得至IVF F2代小鼠、IVF父源性F2代小鼠、IVF母源性F2代小鼠。(IVF F1代雌雄小鼠合笼得到IVF F2代小鼠,IVF F1代雌鼠与自然妊娠雄鼠合笼得到IVF母源性F2代小鼠,IVF F1代雄鼠与自然妊娠雌鼠合笼得到IVF父源性F2代小鼠。)通过提取小鼠脑组织基因组DNA,采用抗甲基化抗体免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP)脑组织基因组DNA法,获取纯化的甲基化DNA,然后应用荧光素Cy3进行标记；应用荧光素Cy5标记Reference DNA。标记的DNA样品与NimbleGen Mouse MM8 CpG岛及启动子甲基化芯片杂交,进行电脑辅助图像采集和数据分析,结果显示IVF F1代小鼠脑组织中,非印记基因Col18α1, Cdc5l, Zfp191,Zfp639表现为超甲基化,分别对IVF F2代小鼠、IVF父源性F2代小鼠、IVF母源性F2代小鼠和自然对照小鼠(分3周龄组和10周龄组)进行BSP法检测目的基因Col18α1、Cdc5l、Zfp191和Zfp639DNA甲基化状态,用焦磷酸测序法检测并验证目的片段Col18α1、Cdc5l、Zfp191和Zfp639部分CpG位点甲基化状态,应用实时PCR分析IVF F2代小鼠脑组织DNA甲基化和mRNA的表达水平。结果：IVF组F2代小鼠脑组织中目的基因Col18α1、Cdc5L、Zfp191和Zfp639与自然对照组小鼠相比较,存在mRNA表达差异。其中,IVF F2代3周龄断乳期小鼠脑组织中col18α1、Zfpl91mRNA表达下调,差异无统计学意义(p>0.05); Cdc5l和Zfp639mRNA表达上调,差异有统计学意义(p<0.05)。IVF父源性F2代3周龄断乳期小鼠和IVF母源性F2代3周龄断乳期小鼠脑组织中Zol18α1、Cdc5L、Zfp191mrnA表达均下调,差异有统计学意义(p<0.01),Zfp639mRNA表达也下调,差异有统计学意义(p<0.05)。各种类型IVF F2代10周龄成年期小鼠脑组织中Col18α1mKNA表达均下调,差异有统计学意义(p<0.01)；Cdc5lmRNA表达差异均无统计学意义(p>0.05)；Zfp639mRNA表达均上调,差异有统计学意义(p<0.01)。IVF母源性F2代10周龄成年期小鼠脑组织中Zfp191mRNA表达下调,差异有统计学意义(p<0.01),而IVF F2代和IVF父源性F2代10周龄成年期小鼠脑组织中Zfp191 mRNA表达差异无统计学意义(p>0.05)。3周龄的IVF父源性及母源性F2代小鼠,与自然对照组相比较,大部分CpG位点目的基因DNA呈显著高甲基化,一些CpG位点则呈显著超甲基化,另一些CpG位点虽也呈高甲基化趋势,但差异没有统计学意义。各种类型的IVF F2代10周龄成年期小鼠脑组织中大部分CpG位点呈显著超甲基化,差异有统计学意义(p<0.01)；一些CpG位点呈显著高甲基化,差异有统计学意义(p<0.05)；另一些CpG位点虽也呈高甲基化趋势,但差异无统计学意义(p>0.05)。结论：IVF-ET过程可以改变IVFF2代小鼠脑组织非印记基因Col18α1、Cdc5l、Zfp191和Zfp639mmNA的表达以及DNA甲基化修饰,并且这一改变在3种类型IVF F2代小鼠从3周龄断乳期到10周龄成年期之间持续存在。