高敏cTnI免疫层析技术优化及其用于免疫联合干式生化检测研究

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目前,各种国际临床指南认定ACS综合症临床诊断金标准是心肌肌钙蛋白(cardiac troponin,c Tn)中I亚基(cTnI)和T亚基(c Tn T)的浓度水平。高灵敏度cTnI检测试剂对于心肌梗死的阴性预测准确度可达99%,结合临床其他的辅助诊断,可以明显降低ACS的漏检率。但目前临床使用的检测方法存在着检测速度慢和灵敏度低等问题,开发出更加精准和更加快速的cTnI浓度测定方法,有助于急诊科快速筛选出ACS患者,对症下药,缓解急诊科的拥挤情况。此外高胆固醇是形成心肌梗死的重要诱因之一,高浓度胆固醇会导致心脏血管中粥样动脉硬化的形成,从而引发心肌缺血,导致心肌梗死。因此在心肌梗死诊断中,同时对胆固醇类指标进行检测,可以更好地制定心肌梗死患者治疗方案,而目前胆固醇类指标的测量都是在大型生化仪中进行,在胸痛中心无法方便快速检测。侧向流免疫层析技术是一个经典的体外诊断技术平台,能快速提供测量结果,且生产、储存和运输成本都很低,可应用于各种标志物的检测,适用于急诊科室的使用。但目前的侧向流免疫层析试剂在cTnI检测上存在着灵敏度不够高、准确度低以及无法实现胆固醇类生化指标检测等问题。针对以上问题,本论文通过优化侧向流层析系统的灵敏度与精密度,建立新型干式生化和免疫联检侧向流系统,研制了可实现高灵敏度cTnI检测的干式生化免疫联检侧向流系统,能够显著提升床旁诊断技术(Point of care testing,POCT)平台的性能和拓展性。论文的主要内容有:(1)为筛选出联检系统中cTnI所需的抗体,基于非变性增强化学发光(Enhanced Chemiluminescence,ECL)Western blotting技术,先通过非变性Western blotting,对制备的抗体进行筛选,保持了cTnI在血清中原始状态,确保选择的抗体能有效地解决了cTnI的样本漏检和灵敏度不足的问题。再通过临床样本的验证,对所选抗体对进行了确认,为建立cTnI检测提供了抗体原料。(2)为改善联检系统中cTnI的精密度,分别研究了侧向流层析系统各组分对于精密度的影响,首先优化样品垫的样品处理液配方,优化配方后可以将试剂精密度控制在10%-15%;再通过调整荧光微球的不同处理方式,确认最优的处理方式可将精密度控制在6%以内。最后基于以上结果研制了一套微流控芯片进行验证,与常规试剂条相比,该芯片对于cTnI的测量时间为10 min,精密度控制在5%以内。(3)为进一步在联检系统中改善cTnI的精密度,在侧向流系统中引入了内控校准改善系统,首先筛选不同的内控校准系统,通过对数据的分析处理,选择了BSA校准改善系统。再优化了BSA系统的反应体系,确定了最优反应条件为:cTnI和1 mg/m L的BSA混合包被,BSA羊多抗与Cy5以摩尔比1:2结合,最终将联检系统中cTnI的精密度控制在3%-5%,达到准确定量的临床检测需求。(4)建立了同时检测CK-MB、Myo和cTnI三种免疫指标与胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和尿酸五种生化指标的联检系统。首先对建立联检系统所需材料和反应体系等进行了确定,然后进行了标准曲线的拟合,从标准曲线拟合的数据中可看出试剂条的性能LOD等能够符合临床需求。再针对检测系统的重复性进行了测量,同时还进行了各检测标志物之间的特异性反应研究,确保在临床使用过程中各指标之间不存在交叉干扰反应。最后通过临床样本的对比结果说明本试剂条的检测结果与预期相符合。联合多指标不同方法学的检测系统可短时间内获得更多样的检测结果,对于临床诊断具有极大的意义。
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