实验目的：　　 疟疾是由蚊媒传播的热带地区最常见的寄生原虫感染性疾病。恶性疟原虫是最具致死性和危害性最大的原虫种属。全球每年有3～5亿人感染恶性疟原虫,200多万人死亡。红内期中红细胞表面表达的原虫抗原是介导各种临床症状的病理基础,同时也是宿主保护性免疫系统作用的靶点,如:恶性疟原虫红细胞表面抗原-1(PfEMP1),可介导原虫感染红细胞黏附于微血管壁和未感染红细胞,引发脑疟和胎盘疟疾发生。脑疟(CerebralMalaria,CM)是疟疾感染后最为严重的临床症状,仅撒哈拉南部非洲,每年有100万5岁以下儿童死于恶性疟原虫感染。由于抗药疟原虫和耐杀虫剂蚊的出现,在过去数十年中,开发新型有效的措施以抑制此种感染性疾病已成为全球亟待解决的问题。　　 近年研究发现一大分子量原虫分泌蛋白家族——恶性疟原虫表面相关散布基因家族(surface-associatedinterspersedgene,surf),表达于感染红细胞表面,可能是介导脑疟发生的恶性疟表面抗原之一。同时,免疫学相关研究表明,前炎症细胞因子的过度释放可介导脑疟发生。FLR9是参与CM发病的重要分子,主要通过在脑组织募集免疫细胞,诱导Freg和/或协同IFN-γ信号来促进CM发生。CQ现在被用作胞内酸化(TLR3、7、8和9活化所必需)抑制剂来治疗自身免疫病。因此,疟疾感染过程中,CQ可能通过TLRs来影响DCs的功能,从而调节固有免疫应答以及随后的适应性免疫应答,为抑制的脑疟发生提供可能。　　 为此,本研究通过分子生物学和免疫学手段,检测不同原虫株(实验株:3D7A和3D7B,野生株:MS814A1和MS814A5)中.surf家族成员在红内期各阶段的转录水平和转录模式,探讨其作为疟疾感染阻断疫苗候选抗原的可能性。通过构建融合表达SURFIN4.1蛋白的不同区域与Ty和绿色荧光蛋白(Greenfluorescenceprotein,GFP)的表达载体,体外转染恶性疟原虫泰国分离株MS822,通过免疫印迹(WesternBlot)检测融合蛋白表达情况;通过间接免疫荧光(IFA)检测荧光信号定位,从而明确SURFIN4.1在感染红细胞内的定位和介导此蛋白转运的蛋白序列,为进一步的功能分析提供理论依据。并在体内研究了CQ对实验性脑疟模型(Pb.ANKA感染C57BL/6小鼠)中宿主免疫应答的影响。从而为恶性疟的防控和治疗工作提供充实的理论和实验依据。　　 实验方法：　　 1、恶性疟原虫体外培养　　 采用常规方法体外培养恶性疟原虫3D7A,3D7B,MS814A1,MS814A5和MS822株。其中3D7A,3D7B,MS814A1和MS814A5株在Percoll-Sorbitol方法同步化处理后,进行surf家族成员转录水平的检测;MS822株为转染原虫宿主株,经相同方法同步化处理后,在裂殖体期原虫＞5%时,可用于转染。　　 2、总RNA的提取和反转录获取cDNA　　 于-80℃冰箱中取出1000μl冷冻的恶性疟原虫TRIzol混合液,室温融化5min,按TRIzolLS试剂使用说明提取总RNA。用紫外分光光度仪检测其吸光度(A260/A280值),检测RNA纯度并计算其浓度。反转录采用随机引物法,按SuperscriptⅢ试剂使用说明操作,获得的cDNA于-20℃保存备用。　　 3、质粒构建　　 疟原虫数据库PlasmoDB4.0中surf相关编码基因的获取,RT-PCR标准质粒的制备,SURFIN4.1蛋白编码基因中各功能域相关引物的设计。目的片段采用常规PCR方法扩增,采用凝胶回收提取试剂盒纯化PCR产物后,用于质粒构建。　　 4、实时荧光定量PCR测定及熔解曲线的分析　　 实时定量PCR的反应体系为2xPowerSYBRgreen反应混合物12.5μl,cDNA模板2μl,10pmol/μl上、下游引物各0.25μl,三蒸水10μl。反应条件为预热50℃2min;95℃10min;95℃15s,62℃1min;68℃7s;共50个循环。循环结束后进行熔解曲线分析。在同一次反应中设置标准质粒反应组(4个浓度分别1×108、1×107;1×106;1×105;1×104;1×103;1×102;1×10-1;1×10°copies/μl),所有反应设3个重复。用实时定量荧光PCR仪ABI7300软件,根据质粒标准品建立标准曲线,计算待测样品中各基因拷贝数。　　 5、Gateway技术中pEN克隆和表达载体的构建　　 本研究中所有转染相关质粒均采用Invitrogen公司的GATEWAYMultisite特异性重组方法进行构建。　　 6、恶性疟原虫体外转染　　 采用QiagenMaxi质粒提取试剂盒提取纯化待转质粒,调质粒浓度为1000ng/ul以备转染。收集新鲜的人O型血红细胞,采用ICM培养基,1500rpm5min洗涤3次。充分混合100ul待转质粒(浓度:1000ng/ul)与300ul人O型血红细胞,0.32KV、960uF条件下,应用Bio-RadGenePulserⅡ转染仪(Bio-Rad,Hercules,CA)进行电转。将转染后的红细胞转移至15ml管中,采用5mlICM1500rpm5min洗涤3次后转入5mlCM培养基(Ht:0.25%),加入晚期裂殖体阶段的恶性疟原虫3D7株和野生型MS822株感染红细胞,调原虫血症为0.2%,常规条件下体外培养。上述转染步骤均在冰上操作。转染后第5天加10nMWR99210(疟原虫二氢叶酸还原酶抑制剂)筛选阳性克隆。通常,表达GFP融合蛋白的原虫可在转染后20～35天被检测到,10nMWR99210可保持培养基中转染原虫的阳性率为100%。　　 7、Site-directedmutagenesis(位点特异性突变)　　 采用Toyobo的位点特异性突变试剂盒通过使用megaprimer转变检测区域的蛋白序列,以明确介导转运的蛋白功能区。　　 8、重组蛋白SURFIN4.1-3Ty-GFP的检测　　 (1)IFA定位重组蛋白　　 采用丙酮一甲醇或100%甲醇试剂对原虫感染红细胞的薄血膜涂片-20℃下固定10min。采用含5%BSA(牛血清白蛋白)的PBS封闭薄血膜片1小时之后,采用鼠抗-Ty的单克隆抗体(1:500,Diagenode,Mab-054-050)和兔抗-SBP1的多克隆抗体37℃孵育1小时。洗涤两次之后,采用抗鼠Alexa-Fluor488(公司:Invitrogen)和抗兔Alexa-Fluor594(公司:Invitrogen)及DAPI或Hoechst33256(1mgml/1)共孵育后检测。　　 (2)WesternBlot检测重组蛋白的表达　　 收集成熟滋养体和裂殖体感染的红细胞,采用含蛋白酶抑制剂的PBS(PBS-PI)通过反复冻融三次的方法提取原虫水溶性蛋白。用PBS-PI洗涤两次后,采用含1%TritonX-100冰上孵育30min,提取膜蛋白;不溶性物质采用1%TritonX-100洗涤两次后,离心弃上清,在沉淀中加入2%SDS,室温孵育30min,进一步提取膜连接蛋白。　　 100℃孵育3min,待蛋白充分变性后,采用1×SDS-PAGEloadingbuffer溶解样本,5～20%聚丙烯酰胺凝胶(ATTO公司,日本)进行电泳检测。使用Bio-Rad湿式转膜装置和0.22μmPVDF膜(FFP30/FFP33),在15-20mA转膜过夜。10%的BSA封闭PVDF膜后,采用鼠抗-Ty的单克隆抗体(1:500,Diagenode,Mab-054-050)标记待检测蛋白,之后采用辣根过氧化物酶交联的特异性二抗HRP标记的羊抗鼠IgG(Promega;批号:W4021)和ECL检测试剂盒(Millipore)进行检测。　　 10、实验动物处理、感染及原虫血症观察　　 CQ处理:C57/BL6小鼠随机分为四组:正常感染组(NC);前3h组(pre-3h);后6h组(pro-6h);后3d组(pro-3d)。实验组分别于感染前3h和感染后6h、3d口服给予CQ(50mg/Kg),对照组在相同的时间点接受相同量的生理盐水。　　 TLR9抑制剂处理:H154组,在感染前1天腹腔注射H154(3mg/kg);A151对照组,在感染前1天腹腔注射A151(3mg/kg)。　　 小鼠感染:经腹腔感染1×106Pb.ANKA寄生的红细胞(PRBC),感染不同时间的小鼠经尾静脉采血,制备薄血膜,Gicmsa染色,镜检计数红细胞感染率。　　 11、脾细胞培养　　 无菌取出感染0d、3d、5d小鼠脾脏,用10%FCS-RPMI1640培养液制成细胞悬液,1500rpm离心10min,用0.17MN4Cl裂解红细胞,RPMI1640洗涤两次。以含10%FCS-RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml,于24孔培养板上加入细胞悬液,500ml/孔,每组设2个复孔。于37℃培养48h。350g室温离心10min,收集上清,-80℃保存,待IFN-γ、TNF-α和NO2-检测。　　 12、IFN-γ及TNF-α检测　　 用双抗体夹心ELISA法对小鼠脾细胞培养上清中的IFN-γ以及TNF-α的含量分别进行检测,酶标仪检测450nm处OD值。应用SoftMaxPro4.3.1LS软件分析,绘制标准品标准曲线,计算细胞因子含量(pg/ml)。　　 13、NO2-检测　　 以Griess反应检测脾细胞培养上清中的NO2-含量,100ml上清和Griess反应液100ml室温反应10min,用NaNO2作为标准品,酶标检测仪550nm处检测其OD值。　　 14、脾细胞样品制备及荧光抗体染色　　 DCs检测:每份样品用抗CD11c-FITC单抗、抗CD11b-PE单抗、抗CD45R/B220-PerCP单抗和抗MHCⅡ-APC单抗进行四色分析,另设阴性对照管,在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml,再加入抗CD11c-FITC单抗、抗CD11b-PE单抗和抗CD45R/B220-PerCP单抗进行表面染色,离心去上清后,用0.5mlPBS重悬浮细胞,流式细胞仪进行检测。TLR9检测:每份样品应用FITC标记的抗小鼠CD11c单抗和Biotin标记的抗小鼠TLR9单抗进行双色分析,另设单标CD11c单抗和TLR9单抗对照管。每管预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体2ml。然后用抗CD11c-FITC单抗进行表面染色,振荡器低速混匀,冰浴放置,避光反应30min。每管加入2ml含2%FCS的PBS,1500rpm离心5min,弃上清,洗涤两次。然后加入固定透膜夜250μl,4℃孵育1h。再加2ml1×wash固定透膜洗液,1500rpm离心5min洗涤1次,弃上清。每管加100ul含2%FCS的PBS重悬细胞。加入抗-TLR9-BiotinmAb进行胞内标记,4℃孵育30min。每管加入2ml含2%FCS的PBS,1500rpm离心5min,弃上清,洗涤两次。加入抗-Streptavidin-PE进行胞内标记,4℃孵育30min。每管加入2ml含2%FCS的PBS,1500rpm离心5min,弃上清,洗涤两次。每管加入500μl2%多聚甲醛固定液重悬,静置15min,上机。　　 15、统计学处理　　 应用SPSS11.5统计学分析软件。单因素方差分析比较各组均值的显著性差异。P小于0.05为差异显著。　　 实验结果：　　 1、荧光定量RT-PCR实验结果的分析　　 结果显示,在3D7A,3D7B和MS814A5中surf基因各成员在环状体期高度表达,在滋养体期表达水平显著下降,而在裂殖体期转录水平再度升高。其中,3D7A和3D7B中各不同时间点,surf基因家族中surf4.1和surf13.1转录水平明显高于其它家族成员。不同于surf4.1在环状体和裂殖体期高度转录表达的特点,surf13.1的高度转录表达主要在环状体期原虫,提示其在恶性疟原虫感染红细胞早期,胞内环境的建立过程中发挥重要作用。在MS814A1和MS814A5样本中,同样可在裂殖体期检测到surf4.1基因不同于其它surf基因的高度转录表达,且其转录水平显著高于裂殖体期原虫主要抗原PfAMA1。Sutf4.1在裂殖体期的高度表达,提示此基因编码的蛋白SURFIN4.1在疟原虫裂殖子侵袭过程中可能发挥重要作用。　　 2、SURFIN4.1蛋白在3D7株中新发现的编码序列和蛋白序列　　 本研究中,通过检测基因组DNA(gDNA)和cDNA中SURFIN4.1的编码序列,我们发现,PlasmoDB数据库中结果有误。在3D7株中,SURFIN4.1的第一个内含子序列内部,核苷酸位点2371.2589bp:"attaatccttttggaacattttcttccaaaaagaaaaaaggaaagtcagacgaagaaggtatgatgtga"属外显子区域,且可检测到终止密码子"TGA"。因此,在3D7株中SURFIN4.1蛋白不含胞内色氨酸富含区(WRD),在其跨膜区之后仅有一个19个氨基酸组成的短小的胞内尾。在FCR株中,SURFIN4.1原第二个内含子区域内部序列"GTGATGAATGAATGTAAAAGAGACGAGTGGGAAGAACATCGAGGAGATTTTTTACAAATCTGTTTAG"实为外显子,且可检测到内部终止子"TGA"。因此,在FCR株中SURFIN4.1蛋白仅含有一个色氨酸富含区。　　 3、重组蛋白表达情况的检测　　 在SURFIN4.1Fullleith,SURFIN4.1CV1T,SURFIN4.1CT,SURFIN4.1CV1,SURFIN4.1Ner-TM,SURFIN4.1Nter-TM-Cyt,SURFIN4.1syn-N-4er-TM-Cyt和SURFIN4.1TM中,可检测到目的条带预测值为,124.44kDa、96.1kDa、62.96kDa、92.79kDa、38.08kDa、43.88kDa、43.94kDa和38.11kDa。在MS822未转染原虫中不能检测到相应条带,表明上述蛋白条带的特异性。同时,上述蛋白均存在于TritonX-100提取样本中,提示SURFIN4.1膜蛋白的特性。当半胱氨酸富含区存在时,SURFIN4.1重组蛋白同时存在于SDS提取样本中,提示SURFIN4.1蛋白在转运或茂氏点定位过程中可能通过半胱氨酸富含区与其它蛋白间相互作用。　　 4、重组蛋白荧光定位的检测　　 SURFIN4.1蛋白的全长融合Ty-GFP标签后检测结果显示:此重组蛋白的荧光信号在感染红细胞胞浆内呈点状分布,并与茂氏点标记蛋白PfSBP1完全重合,此结果表明SURFIN4.1-Ty-GFP重组蛋白为原虫外分泌蛋白,包含可供蛋白跨越纳虫泡膜(PVM)外分泌的全部信号,提示内源性SURFIN4.1蛋白可能同样是外分泌蛋白,前期研究结果可能有误。　　 SURFIN4.1蛋白各功能区分段分析结果表明,Vat区(氨基酸位点:187-770)不存在SURFIN4.1蛋白跨PVM膜外分泌所必需序列。SURFIN4.1的跨PVM膜外分泌过程需要跨膜区(TM)的参与,提示SURFIN4.1蛋白与其它PNEPs蛋白相似的转运机制。进一步研究发现SURFIN4.1蛋白N端的50个氨基酸,跨膜区(TM)和胞内区(Cyt)共同作用可介导此重组蛋白定位于茂氏点。提示,茂氏点定位序列包含在N-ter-TM-Cyt此结构的105个氨基酸内,且N端1-50个氨基酸序列不能被其它非相关蛋白,如:PfSynaptojanin蛋白N端的1-50个氨基酸替代,提示,SURFIN4.1蛋白的N端包含茂氏点定位的所必需的重要蛋白序列。　　 5、Pb.ANKA感染后不同时间的原虫血症及生存率　　 对照组小鼠于感染后8-11天全部死亡,出现典型的CM症状,包括被毛竖起,呼吸急促,行动迟缓和原虫血症约20%。CQ处理会显著增强感染小鼠的生存率。尽管CQ处理组的所有小鼠在感染后20-23天死亡,但均未出现神经系统症状。与对照组相比,所有CQ治疗组的原虫血症升高缓慢,在死亡高峰期的感染率约为30%。这些结果表明,CQ处理能成功保护C57BL/6小鼠抵抗.Pb.ANKA感染引起的CM。　　 6、CQ处理降低DCs的TLR9表达,抑制DC亚群活化和DC成熟　　 我们比较了感染后不同时间DCs的TLR9和MHCⅡ表达水平以及DCs亚群的活化水平。与对照组相比,CQ处理组的TLR9表达水平显著下降。与对照组相比,CQ前3h组的TLR9的表达水平在感染后3d、5d显著下降(P＜0.05)而CQ后6h组则没有变化,提示体内给予50mg/kg的CQ处理能够抑制急性感染期的TLR9活化。前3h组在感染后3d、5d,后6h组在感染后3d,mDC的数量减少的。在感染后3、5d,前3h和后6h组的pDC的数量也减少。CQ处理也会影响DCs上MHCⅡ类分子的表达。在感染后3d、5d,前3h和后6h组的CD11c+MHCⅡ+DCs显著低于对照组。　　 7、CQ抑制适应性免疫应答和NO的分泌　　 CQ会在感染后3d、5d显著降低CD4+T细胞表面CD69分子的表达,提示CD4+T细胞的活化严重受损。在感染后5d,前3h组和后6h组中的Th1细胞(CD4+T-bet+IFN-γ+)数量均下降。我们检测了脾细胞上清中的IFN-γ、TNF-α和NO分泌水平。与对照组相比,前3h和后6h组在感染后3d、5d,IFN-γ和NO水平显著降低;在感染后3d,TNF-α水平显著降低(P＜0.05)。　　 8、TLR9的抑制剂与CQ对免疫应答具有相似的效应对照组和A151组的全部小鼠于感染后8-11天死亡,原虫血症峰值大约为20%(图4A)。虽然H154组中大多数小鼠于感染后20-23天死亡,但原虫血症升高缓慢,峰值大约为40%。在感染后5d,H154显著抑制DCsTLR9分子和MHCⅡ类分子的表达,下调mDC的数量,但不影响pDC。IFN-γ、NO和TNF-α的水平在感染后5d也下降。　　 结论：　　 1、Surf基因各成员在红内期的环状体和裂殖体期高度表达;　　 2、Surf4.1在红内期,特别是裂殖体期的表达水平显著高于surfs其它家族成员;　　 3、泰国分离株MS814是不同于常用实验室株3D7的新表型;　　 4、SURFIN4.1蛋白含有一个或不含色氨酸富含区(WRD);　　 5、Nter-TM-cyt(105个氨基酸)可介导重组蛋白在毛雷尔氏小体(MCs)的定位;　　 6、SURFIN4.1重组蛋白的外分泌需要N端的氨基酸序列;　　 7、CRD结构域可能通过与内源性SURFIN4.1蛋白相互作用介导重组蛋白转运;　　 8、本研究为TLR9参与CM发病机制提供了证据;　　 9、CQ通过抑制TLR9功能来抑制前炎症免疫应答,从而抑制CM的发生,通过抑制TLR9的活化来预防过强炎症应答介导的重症疟疾和病理损伤,为疟疾防控提供了一个新的策略。