土壤宏基因组文库构建与土壤微生物群落结构指示方法的初步建立

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建立了一套从土壤中高效率提取微生物总DNA的方法,该方法对两种潮土样品的DNA提取量分别为14.32μg/g·干土与10.06μg/g·干土,提取效率分别为91.66%与89.02%,对革兰氏阳性细菌也有较好的提取效果。粗提DNA用半透膜透析回收纯化,纯化后的DNA可以进行16sRNA基因PCR扩增,酶切等分子生物学操作,具有较高的质量。 大量提取pUC19质粒,BamHI酶切后用牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)进行脱磷处理。纯化后的土壤DNA用限制性内切酶Sau3AI随机切割,以透析袋分别回收2-6kb和6-9kb的酶切片段,然后用T4连接酶与上述脱磷载体连接。酶连产物分别通过感受态细胞和电击的途径转化大肠杆菌DH5α,涂布amp平板,培养后快速提取质粒检测外源片段的插入效率。结果表明,通过感受态细胞的转化途径,2-6kb酶切片段的插入率在50%左右;而6-9kb的酶切片段的插入率为30%左右,前者明显高于后者。对于2-6kb的片段,电转化的效率要比感受态法转化高10-70倍左右,而对于6-9kb的片段两种方法则相差无几。从电转化所建立的2-6kb外源片段的文库中随机选取100个白斑,提取质粒并用EcoRI酶切后电泳,确定外源片段插入的频率与大小分布,结果表明外源片段的平均插入大小为2.7kb,其中44%的插入片段大于3kb。约83%的插入片段大小在2-4kb之间。根据估算,依上述建库方法,每克土壤样品可得到5000-10000个转化子。 采用高盐法提取九株甲基对硫磷降解细菌的总DNA,然后用ERIC-PCR对其进行鉴别,实验结果显示每种细菌都具有可稳定重复的特征指纹图谱,根据这些条带对九株细菌进行相似性分析和聚类,结果与依照16sDNA进行分类的树状图基本一致,说明ERIC-PCR是一种可以有效区分细菌不同菌株的方法;同时,通过上述实验确定了ERIC-PCR的最适反应参数。将纯化后的土壤DNA进行适当的梯度稀释,然后进行ERIC-PCR扩增,电泳结果显示出复杂的特征图谱。
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