阿尔泰金莲花总黄酮制备工艺及质量标准初步研究

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目的:在对阿尔泰金莲花进行系统化学成分研究基础上,优选阿尔泰金莲花总黄酮提取物(AJTF)制备工艺.并对其质量标准和抗炎镇痛活性进行初步研究。方法:1)采用回流提取法制备阿尔泰金莲花70%乙醇提取物,运用高速逆流色谱法,以乙酸乙酯-正丁醇-水(2:1:3,V:V:V)为溶剂系统,分离纯化阿尔泰金莲花中的活性成分,并对其活性成分进行质谱分析;2)以提取物中的荭草素2"-O-β-L-半乳糖苷(orientin-2"-O-β-L-galactopyranosylide,OGA)含量为评价指标,采用 L9(34)重复正交试验设计优选合适的OGA提取工艺;在此基础上通过比较提取液在6种大孔吸附树脂上的吸附与解吸附特性,优选合适的吸附纯化用树脂,考察OGA在选定大孔树脂上的吸附动力学特征;利用单因素试验考察上样液浓度、吸附流速、除杂溶媒用量等参数对大孔树脂纯化效果的影响,优选OGA大孔树脂纯化工艺;最后采用MCI柱对OGA单体进行制备。3)以总黄酮含量及DPPH自由基的清除率为评价指标,采用L9(34)重复正交试验设计优选AJTF的提取工艺:采用大孔树脂法纯化AJTF,通过对6种大孔树脂的吸附-洗脱能力进行考察,筛选出适宜的大孔树脂型号,通过对上样液浓度、吸附流速、除杂溶媒用量等因素进行考察,优选AJTF大孔树脂纯化工艺;4)参照《中国药典》(2015年版)和中药、天然药物稳定性研究技术指导原则,对AJTF的质量标准和稳定性进行初步研究。5)采用二甲苯致小鼠耳肿胀及冰醋酸致小鼠扭体法对AJTF和OGA的抗炎镇痛作用进行初步评价。结果:1)从阿尔泰金莲花70%乙醇提取物中分离纯化得到3个化合物,分别为:荭草素2"-O-β-L-半乳糖苷(Ⅰ)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅱ)、荭草素(Ⅲ),其中化合物(Ⅰ)和(Ⅱ)均为首次从该植物中分离得到;2)阿尔泰金莲花OGA的优选提取工艺条件为:乙醇体积分数70%,料液比1:30(g·ml-1),提取时间1.5h,提取次数2次;该工艺得到阿尔泰金莲花中OGA的含量为29.02±0.46mg·g-1;优选出的D101型大孔树脂对提取液的平衡吸附数据符合Langmuir等温方程,属于单分子层吸附,低温有利于吸附,吸附行为符合准二级吸附动力学方程,吸附速率由液膜扩散和颗粒扩散共同控制;OGA优选纯化工艺为将6BV的0.2779mg.mL-1提取液,以2mL·min-1的流速过D101型大孔树脂,加水5BV除杂,30%乙醇7BV富集OGA,洗脱流速1mL·min-1,得到浸膏中OGA的质量分数为33.20%,转移率为90.23%,经过MCI柱制备出含量为968.9437mg·g-1的OGA。3)AJTF优选提取工艺条件为:乙醇体积分数70%,料液比1:30(g·mL-1),提取时间1.5h,提取次数2次;该工艺得到的总黄酮含量为170.53±3.30mg.g-1;优选AJTF纯化工艺为将3BV的1.47mg·mL-1 AJTF的提取液,以2mL·min-1的流速过D101型大孔树脂,加水4BV除杂,加30%乙醇7BV富集总黄酮,洗脱流速2mL.minin。所得浸膏中总黄酮平均质量分数为76.52%,平均转移率66.49%;4)建立了 AJTF的理化鉴别、薄层色谱、HPLC鉴别方法;依据试验结果初步限定AJTF中水分不得超过5%,炙灼残渣不得超过1%,重金属不得超过20ppm,砷盐不得过0.5ppm,干燥失重不得过1%,总黄酮含量不得低于624mg·g-1;其中标识性成分OGA含量不得低于236mg·g-1;高温和强光对AJTF外观、色泽和总黄酮含量及标识性成分含量均无明显影响,高湿对AJTF稳定性有影响,因此AJTF应该置干燥处,密封保存。5)与模型组比较,低、中、高剂量组的AJTF(125、250、500mg·kg-1)及OGA(25、50、100mg.kg-1)能明显抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀的发生(p<0.01),其抑制率分别为:AJTF(25.52%、40.61%、48.34%),OGA(33.77%、43.11%、50.16%);AJTF及OGA各剂量组能显著减少醋酸引起的小鼠扭体反应次数(p<0.01)。结论:对阿尔泰金莲花进行了系统化学成分研究,优选AJTF制备工艺,初步建立了 AJTF质量标准,药理试验提示AJTF及OGA具有一定的抗炎和镇痛作用,以上研究为阿尔泰金莲花的开发利用提供研究基础。
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