论文部分内容阅读
背景:小胶质细胞是大脑内常驻免疫细胞,对中枢神经系统损伤反应灵敏,几乎在脑缺血发作后立即被激活,并通过M1和M2表型的极化发挥组织损伤和神经保护双重作用。因此,调控小胶质细胞的不同表型及功能被认为是减轻缺血性脑损伤、改善卒中预后的重要靶点。细胞型朊蛋白PrPC是一种铜结合的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定糖蛋白,在中枢神经系统内广泛表达。当前研究已经证实PrPC可在脑缺血/再灌注损伤后发挥脑保护作用,然而对于PrPC在脑缺血/再灌注损伤后小胶质细胞激活过程中扮演的角色至今仍无相关研究,这是本课题拟解决的问题。方法:选取出生1-3天的WT（野生型）、KO(PrPC敲除,Prnp-/-)和TGA(PrPC过表达,Prnp+/+)新生小鼠。分离、培养、纯化新生小鼠大脑皮层小胶质细胞,构建糖氧剥夺/复糖复氧（OGD/R）模型。通过免疫荧光染色标记观察各组小胶质细胞在OGD/R损伤后的形态学变化;并通过免疫荧光双重染色及流式细胞术检测OGD（2h）/R（48h）后小胶质细胞中PrPC蛋白的表达情况。随后,利用流式细胞术检测各组小胶质细胞在OGD/R损伤后的激活及表型分化情况,以及细胞因子微球检测技术（cytometric bead array,CBA）检测不同基因型小胶质细胞促炎及抗炎因子的释放。将小胶质细胞条件培养基与小鼠海马神经元细胞系（HT22细胞）进行体外共培养,使用流式细胞术检测HT22细胞凋亡情况,观察OGD/R损伤后小胶质细胞中PrPC对小鼠HT22海马神经元细胞存活的影响。结果:1.OGD/R损伤后,WT组小胶质细胞中PrPC蛋白表达水平明显上调（p<0.05）;WT、KO及TGA组小胶质细胞在OGD/R损伤后均有不同程度激活;KO组小胶质细胞在正常培养条件下和OGD/R损伤刺激后,活化的小胶质细胞比例均较另外两组明显增加（p<0.05）;相反,相较于WT组和KO组,TGA组小胶质细胞在OGD/R损伤后,其活化程度明显降低（p<0.05）。2.OGD/R损伤后,WT组（p<0.01）、KO组（p<0.05）及TGA组（p<0.05）M1型小胶质细胞比例均明显增高,WT组小胶质细胞M1表型相关促炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6表达水平明显增高（p<0.01）;KO组小胶质细胞在正常情况及OGD/R损伤后,M1表型比例较其他两组细胞均升高,TGA组M1表型比例低于另外两组,差异具有统计学意义;OGD/R损伤后KO组促炎因子IFN-γ的分泌高于WT组（p<0.01）及TGA组（p<0.01）,KO组促炎因子IL-6的分泌高于TGA组（p<0.01）,TGA组促炎因子TNF-α（p<0.05）、IFN-γ（p<0.05）、IL-6（p<0.01）的分泌均低于WT组;OGD/R损伤后WT、KO、TGA三组小胶质细胞M2型比例及相关抗炎因子分泌未见明显差异。3.KO组未经OGD/R处理的小胶质细胞与HT22小鼠海马神经元共培养后,HT22细胞凋亡率明显高于WT组及TGA组（p<0.05）。经过OGD/R处理的小胶质细胞与HT22小鼠海马神经元共培养后,KO组的凋亡率高于Control组（p<0.05）,高于WT组以及TGA组（p<0.05）,TGA组的凋亡率低于WT组（p<0.05）。结论:1.PrPC可能在小胶质细胞静止状态的维持中发挥一定作用,并且在小胶质细胞由静止状态到激活状态的转换过程中发挥作用。2.OGD/R损伤后,PrPC可能通过降低M1表型小胶质细胞的比例发挥保护作用,而不参与调节M2表型小胶质细胞的比例。3.PrPC通过调控小胶质细胞活化及表型转化进而影响神经元活性。