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第一部分hiPSCs分化为心肌细胞后线粒体代谢及蛋白表达变化目的:观察hiPSCs分化为hiPSC-CMs后线粒体代谢变化与PGC-1α及其下游氧化代谢相关蛋白表达的相关性。方法:(1)应用PGM1人多潜能干细胞培养基复苏培养hiPSCs,并每天更换培养基;使用免疫荧光染色和流式细胞仪检测hiPSCs的多能标志物表达情况。(2)用时序性短暂激活/抑制Wnt信号通路的方法诱导hiPSCs分化为心肌细胞;倒置显微镜下观察细胞生长状态;使用qRT-PCR、免疫荧光染色和流式细胞仪检测hiPSC-CMs心肌特异性标志物表达情况。(3)实验分为两组:hiPSCs组与hiPSC-CMs组,采用线粒体压力测试试剂盒检测耗氧率(OCR);使用ATP检测试剂盒和JC-1探针分别检测细胞内ATP含量与线粒体膜电位;使用透射电镜和Mitotracker Red染色观察线粒体形态;使用Western blot检测PGC-1α及其下游氧化代谢相关蛋白表达水平。结果:(1)hiPSCs呈集落生长,集落边缘光滑,细胞排列紧密,增殖速度较快。免疫荧光学染色检测结果显示hiPSCs表达多能性标志物OCT4、SOX2、SSEA-4和TRA-1-60,流式细胞仪检测OCT4阳性表达量为95%。(2)诱导培养的第8-10天观察到hiPSC-CMs的开始跳动,第12天可观察到剧烈的自发搏动。qRT-PCR结果显示hiPSCCMs表达心肌特异性标志物TNNT2与MYH6;免疫荧光染色结果显示hiPSC-CMs心肌结构标志物cTnT、α-actinin和Cx43表达呈阳性;流式分析结果显示hiPSC-CMs的cTnT阳性表达率达98.6%。(3)与hiPSCs相比,hiPSC-CMs的基础呼吸、最大呼吸、ATP关联呼吸以及非线粒体呼吸的OCR值增高,ATP含量与线粒体膜电位增高;线粒体形态发生改变,hiPSCs中线粒体主要为颗粒状,hiPSC-CMs中为杆状;PGC-1α及其下游转录因子NRF1、ERRα和涉及三羧酸循环、氧化磷酸化、脂肪酸氧化和线粒体丙酮酸转运等代谢途径的线粒体蛋白表达均显著增高。结论:(1)我们成功诱导未分化的hiPSCs特异性分化为表达心肌特异性标志物的CMs。(2)hiPSCs分化为hiPSC-CMs后线粒体呼吸功能的增强与PGC-1α及其下游氧化代谢相关蛋白表达呈正相关。第二部分PGC-1α调控hi PSC-CMs线粒体代谢的作用及其可能机制目的:探讨PGC-1α调控hi PSC-CMs线粒体代谢作用及其可能机制。方法:(1)使用PGC-1α-siRNA转染hi PSC-CMs,q RT-PCR和Western blot检测PGC-1α的表达情况,并使用线粒体压力测试试剂盒检测耗氧率(OCR)。(2)以不同浓度ZLN005处理hi PSC-CMs,q RTPCR和Western blot检测PGC-1α表达情况,CCK8实验检测细胞活性,筛选出最佳工作浓度并用于后续实验。将实验分为两组:对照组和ZLN005组,使用最佳工作浓度的ZLN005处理hi PSC-CMs,应用线粒体压力测试试剂盒检测耗氧率(OCR),使用JC-1检测线粒体膜电位,倒置显微镜下观察并记录hi PSC-CMs搏动频率,使用Mitotracker Red染色观察线粒体形态并分析荧光强度以反映线粒体数量,q RT-PCR和Western blot检测代谢相关基因表达情况。(3)q RT-PCR和Western blot检测PGC-1α-siRNA对ERRα表达的影响;Co-IP检测PGC-1α与ERRα的蛋白相互作用;实验分为三组:对照组,ZLN005组和ZLN005+XCT790组,在ZLN005激活PGC-1α的同时使用XCT790抑制ERRα蛋白表达,通过线粒体压力测试和Western blot分别检测线粒体呼吸功能与蛋白表达情况。结果:(1)使用PGC-1α-siRNA有效敲低hi PSC-CMs的PGC-1α表达并抑制基础呼吸、ATP关联呼吸以及非线粒体呼吸的耗氧率。(2)8μmol/L为ZLN005的最佳工作浓度,能有效激活PGC-1α表达且无细胞毒性;与对照组相比,ZLN005组的基础呼吸、最大呼吸、ATP关联呼吸和非线粒体呼吸的耗氧率、线粒体膜电位、搏动频率和线粒体数量增高,线粒体形态变为网络状散在分布于胞质中。q RT-PCR和Western blot结果显示ZLN005促进线粒体融合基因表达,抑制线粒体分裂基因表达;ZLN005促进PGC-1α下游转录因子NRF1、ERRα和CPT-1α/β、CS、COXⅣ、COX5B、Cyt C和MPC1等线粒体关键蛋白的表达。(3)在hi PSC-CMs中,PGC-1α-siRNA诱导ERRα表达降低,另外PGC-1α能与ERRα相互结合形成复合物。与ZLN005组相比,ZLN005+XCT790组的基础呼吸、最大呼吸以及ATP关联呼吸显著降低,MFN1/2、CS与COXⅣ等线粒体蛋白表达也显著降低,而与对照组相比几乎无差异。结论:(1)PGC-1α在调控线粒体代谢中具有重要作用。通过ZLN005促进PGC-1α表达能够促进hi PSC-CMs线粒体代谢成熟:线粒体呼吸增强,线粒体膜电位升高,线粒体数量增多,线粒体融合增加,线粒体关键蛋白表达增加。(2)PGC-1α调控线粒体代谢的可能机制是促进下游氧化代谢相关蛋白的表达,其中ERRα在PGC-1α引起的线粒体氧化代谢中具有重要作用。PGC1-α能直接调控ERRα表达并与其相互结合形成共激活复合物调控下游蛋白的表达以增强线粒体功能。