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亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)是一种常染色体显性遗传性的神经退行性疾病。临床表现为不自主舞蹈运动、精神和情感异常以及进行性认知障碍,大多在中老年发病,目前尚无有效治疗方法。遗传学特征是位于4号染色体上的亨廷顿蛋白(huntingtin,Htt)编码区上CAG重复序列异常增多(超过35个),产生氨基末端多聚谷氨酰胺(polyglutamine,Poly-Q)异常扩增的突变亨廷顿蛋白(mutant huntingtin,m Htt)。m Htt,尤其是其氨基末端片段能在神经元细胞质或核内积聚而形成难溶性的聚集物,m Htt及其聚集物具有多种细胞毒性,如干扰细胞内基因表达、诱导氧化应激、引起能量代谢障碍和兴奋性毒性损伤等,这些细胞毒性在HD的发病过程中起着关键性的作用。m Htt氨基末端片段除了在神经元内形成聚集物外,也在内分泌细胞如胰岛和肾上腺髓质细胞中形成聚集物,导致细胞功能异常。研究显示,50%~60%HD患者葡萄糖耐受实验异常,与正常人群相比,HD患者糖尿病发病率显著增加,是正常人群发病率的7倍之多。然而,HD患者继发糖尿病的机制仍不清楚。本研究中,我们利用NIT-1小鼠胰岛素瘤β细胞,通过基因转染技术将表达正常或突变Htt氨基末端片段的真核表达质粒转染NIT-1细胞,观察m Htt对NIT-1细胞活力以及功能的影响,为揭示HD患者继发糖尿病的发病机制提供线索。1.m Htt增加NIT-1细胞凋亡在瞬时转染的NIT-1细胞中,含20个谷氨酰胺重复序列的正常Htt(20Q Htt)氨基末端片段弥散分布在细胞质内;含160个谷氨酰胺重复序列的m Htt(160Q Htt)氨基末端片段也在细胞质内分布,但在多数细胞胞质内可见聚集物形成。为了检测m Htt对NIT-1细胞活力的影响,在转染48小时后,MTT法分析结果显示,与转染空质粒(对照组)和表达20Q Htt的NIT-1细胞组(20Q NIT-1细胞)比较,表达160Q Htt的NIT-1细胞(160Q NIT-1细胞)增殖能力无明显差异。结果提示m Htt对NIT-1细胞的增殖能力无明显影响。接着,我们进一步检测m Htt是否增加NIT-1细胞的凋亡。免疫印迹分析结果显示,160Q NIT-1细胞在凋亡诱导剂staurosporine刺激后,活性caspase-3表达显著高于20Q NIT-1细胞,而20Q NIT-1细胞与对照组间活性caspase-3表达无明显差异。结果提示m Htt使NIT-1细胞对凋亡剂的诱导更加敏感,更易发生凋亡。2.m Htt损伤NIT-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌为了明确m Htt是否影响NIT-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌,在细胞转染20Q或160Q Htt 48小时后,用不同浓度的葡萄糖(5.6mmol/L、11.1mmol/L和24.2mmol/L)刺激细胞半小时,应用小鼠胰岛素酶联免疫吸附测定试剂盒检测培养基中胰岛素含量。结果显示,在高浓度葡萄糖(24.2mmol/L)刺激时,20Q和对照组细胞培养基中胰岛素含量均显著增加,然而,160Q细胞培养基中胰岛素含量仅略有增加,升高幅度显著低于20Q和对照组细胞。结果提示m Htt抑制NIT-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌。为了明确m Htt是否通过影响NIT-1细胞胰岛素的表达而抑制其分泌,在细胞转染48小时后,用以上3种浓度的葡萄糖刺激细胞半小时,分别应用RTPCR和免疫印迹检测细胞内胰岛素m RNA和蛋白质的表达。结果显示,三组细胞高糖刺激时胰岛素m RNA表达均较低糖刺激时明显升高,在同一糖浓度刺激时,160Q NIT-1细胞内胰岛素m RNA表达水平与20Q以及对照细胞无明显差异。然而,高糖刺激时160Q NIT-1细胞内胰岛素蛋白质水平显著低于高糖刺激的20Q NIT-1细胞组。与相同刺激条件的对照组细胞相比,20Q NIT-1细胞内胰岛素蛋白质以及m RNA表达水平均未见明显变化。这些结果提示m Htt对细胞内胰岛素的转录无显著影响,胰岛素分泌的减少与细胞内胰岛素含量降低有关。3.m Htt抑制葡萄糖刺激的胰岛素信号通路的激活胰岛素信号通路对β细胞的生长和胰岛素的合成与分泌发挥重要调节作用,胰岛素和葡萄糖均能通过激活该信号通路而调节β细胞的功能。为了明确m Htt是否通过影响胰岛素信号通路而损伤β细胞,在转染细胞48h后,经KRBH缓冲液孵育细胞抑制细胞自身胰岛素的分泌,再给予外源性胰岛素或葡萄糖刺激细胞后,检测细胞内胰岛素信号通路中重要信号分子的表达及活性。结果显示,160Q NIT-1细胞、20Q NIT-1细胞和对照组细胞经外源性胰岛素刺激后,PI3K活性、Akt磷酸化和FOXO-1磷酸化水平均较相应未刺激组有所增加,且三组细胞间无显著差异。用高糖刺激细胞后,20Q NIT-1细胞和对照组细胞胰岛素信号通路关键分子IRS-2水平、Akt磷酸化和FOXO-1磷酸化水平均显著增高;而160Q NIT-1细胞经高糖刺激后,IRS-2水平、Akt磷酸化和FOXO-1磷酸化水平仅少许升高,其水平显著低于高糖刺激的20Q NIT-1细胞中相应蛋白水平。这些结果提示,m Htt不影响NIT-1细胞胰岛素刺激的胰岛素信号通路的激活,仅损伤该信号通路对葡萄糖刺激的反应性,进而导致β细胞葡萄糖刺激后胰岛素分泌减少。结论:m Htt通过损伤β细胞葡萄糖刺激的胰岛素信号通路的激活而引起胰岛素分泌减少。同时,胰岛素信号通路调节紊乱也促使β细胞发生凋亡,使得β细胞数量减少,进一步使胰岛素分泌总量降低。因此,HD患者葡萄糖稳态失调,易发糖尿病可能与β细胞葡萄糖调节的胰岛素信号通路紊乱有关。