侵染中国天南星科药用植物马铃薯Y病毒属成员的分子生物学研究

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天南星科植物中有许多种类是中国传统的药用植物。几千年来,这些药用植物都是野生的,但是随着人们对这些药用植物需求的增加,逐渐开始人工种植,而病毒病害是这些植物人工种植的一个严重问题。最近我们鉴定了一种侵染半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Ten.ex Breitenb.)马铃薯Y病毒属(genus Potyvirus)成员,序列分析表明这种病毒与大豆花叶病毒(Soyben mosaic virus,SMV)十分相似,于是我们建议将这种病毒鉴定为SMV半夏分离物,并命名为SMV-P。为了进一步鉴定侵染天南星科药用植物的Potyvirus属成员,我们首先用RT-PCR的方法对来自全国不同地区样品进行了检测。在供检的20个样品中,我们从7个样品中检测到了3种Potyvirus属病毒,其中5个半夏病样中含有SMV-P,1个来自江苏射阳的半夏病样含有SMV-P和芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV),该分离物暂命名芋花叶病毒射阳分离物(DsMV-SY1),另一个来自广西南宁水半夏(Tyonium flagellifrme)病样含有魔芋花叶病毒(Konjak mosaic virus,KoMV),该分离物暂命名为魔芋花叶病毒水半夏分离物(KoMV-T)。这是KoMV侵染我国天南星科植物的首次报道。我们测定了大豆花叶病毒杭州半夏分离物3(SMV-PHZ3)单链正义RNA基因组全序列,其全基因组由9734个核苷酸组成(不包括3’-polyA),编码一个山3105个氨基酸组成的多聚蛋白,分子量为353.8kDa。在基因组编码的大部分蛋白中,SMV-PHZ3与大豆花叶病毒杭州半夏分离物1(SMV-PHZ1)和大豆花叶病毒杭州大豆分离物(SMV-GHZ)氨基酸序列相似性约为90%,而在P1蛋白部分,SMV-PHZ3和DsMV的氨基酸序列相似性最高。结果进一步证实,SMV-PHZ3和SMV应该是同种病毒不同分离物。同时还测定了其余5种SMV-P分离物3’术端序列,并在此基础上研究了病毒不同分离物的分子差异和进化关系。我们测定了侵染射阳半夏的DsMV-SY1 3’末端1743个核苷酸。系统进化树进行分析表明DsMV-SY1,香果兰花叶病毒(Vanilla mosaic viurs,VanMV)和其它DsMV亲缘关系较高,成簇明显,而且DsMV分离物之间的关系和SMV分离物之间的关系很相似。Western blot分析表明SMV-P和DsMV有较弱的血清学反应。我们测定了KoMV-T基因组全序列,其全基因组由9596个核昔酸组成,3’-末端具有poly(A)尾。KoMV-T和另一分离物F的P3蛋白氨基酸序列比较发现,两个分离物P3基因其余部分相似性比较高,但是在基因的N端度了中间部分KoMV-T比KoMV-F P3多了6个氨基酸,这可能与致病性有关。CP蛋白氨基酸序列系统进化树分析显示,KoMV分离物以及马蹄莲花叶病毒(Zantedeschia mosaic virus,ZaMV)分离物和JHMV分离物形成远源相关,与其它病毒无明显进化相关性。用GST-P1抗血清免疫金标记发现SMV-P P1蛋白定位在细胞质和叶绿体,而在线粒体、细胞核、液泡、细胞壁等均没有观察到金颗粒标记,在阴性对照中几乎没有观察到金颗粒。P1蛋白进入叶绿体可能也是SMVP致病的一种方式。我们用酵母双杂交的方法验证P1蛋白与SMV-P编码的蛋白不存在互作。进而以SMV-P P1蛋白为诱饵从半夏酵母双杂交cDNA文库中筛选到一个候选寄主蛋白。通过质粒回收后,序列分析表明插入的部分基因与光合作用电子传递链细胞色素b6/f复合体中Rieske Fe/S蛋白氨基酸同源性最高。用5’-RACE的方法获得该基因的全长序列。体外免疫共沉淀进一步证明P1和Rieske Fe/S蛋白互作。通过缺失突变分析表明P1-Fe/S互作的区域主要集中在SMV-P P1 N端,包括1—82位氨基酸,Rieske Fe/S蛋白的缺失突变表明Rieske Fe/S蛋白的信号肽也参与了与P1 N端34—82位氨基酸部分的互作。在大豆和马蹄莲中也同样存在SMV-P1-SFe/S和DsMV-P1-CFe/S的相互作用。共聚焦扫描显微镜下观察到GFP-P1融合蛋白在转基因拟南芥的细胞质中表达,但P1转基因拟南芥没有产生明显症状。为了进一步研究SMV-P各基因功能,以及病毒-寄主之间的互作关系,我们构建了T7和35S启动子控制下的全长cDNA克隆,但其侵染性尚需进一步证明。
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