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慢性缺血性心脏病是导致人类死亡的最常见病种之一,尽管早期多数患者通过药物、介入以及手术方式而得到及时有效的治疗,但远期疗效不理想。主要原因在于局部心肌细胞因缺血、缺氧发生大量不可逆性坏死,且不能有效的自我修复。为了弥补受损心肌组织自身修复能力的不足,人们尝试将外源细胞植入受损心肌内,以期增加心肌细胞数目。同时通过移植细胞分泌促血管生长因子,促进心肌新生血管的形成,改善心肌局部微环境,以达到恢复心肌细胞正常的生理功能。本研究建立猪慢性缺血性心脏病的动物模型,通过直接心外膜下移植携带肝细生长因子的重组腺病毒(Ad.HGF)转染的骨髓间质干细胞(MSCsAdHGF)进行干预,研究MSCsAdHGF联合移植是否有促进缺血心肌局部再血管化,改善缺血心肌微环境,促进移植细胞的存活,抑制心肌细胞凋亡和纤维化,有效地抑制左室重构,保护和改善心脏功能。第一部分HGF对MSCs生物学特性的影响■目的：研究HGF对MSCs增殖、分化及凋亡等生物学特性的影响。■方法：猪髂骨骨髓经密度梯度和贴壁分离法进行分离；无菌培养MSCs,并通过细胞表面标志进行成份鉴定(CD71、CD34、CD44、Ⅷ因子及desmin);以Ad.HGF转染MSCs,检测HGF对MSCs的增殖、分化及缺氧环境下凋亡等生物学特性的影响。■结果：1、刚接种时细胞呈球形悬浮于培养液,48h基本贴壁,3-5d呈克隆样生长,10-12d细胞已达90%融合。免疫组化染色结果显示,CD71、CD44阳性,CD34、VIII因子及Desmin表达阴性。2、HGF明显促进MSCs生长,显示MSCs高表达HGF蛋白；MSCsAd.HGF组的PCNA阳性表达率明显高于MSCsAdNull组(53.9±8.7%；38.4±9.7%)；缺氧下MSCsAd.HGF组凋亡率明显低于MSCsAdNull组((3.5±0.5%；5.8±0.9%)；HGF能有效降低III型胶原纤维的分泌。■结论：1、采用Percoll密度梯度和贴壁相结合的方法,可分离获得纯度高、活性强、生长旺盛的MSCs。2、HGF可以安全、有效的转染MSCs,其携带的HGF基因不论在体外或体内均可获得较高的表达水平。3、HGF具有非常明显促进MSCs的增殖和分化的作用。4、HGF体外具有明显抑制MSCs细胞Ⅲ型胶原蛋白分泌及无氧条件下抑制MSCs细胞凋亡。第二部分直接心外膜下MSCsAd.HGF移植治疗缺血性心脏病的疗效评价■目的研究MSCsAd.HGF联合移植促进心肌局部再血管化；改善缺血心肌微循环；促进移植细胞存活；抑制心肌细胞凋亡和纤维化等作用。■方法(1)模型构建实验用贵州小型香猪40头,前正中切口开胸,游离左冠状动脉回旋支主干套入Ameroid环,通过心电图、冠状动脉造影、彩色多普勒超声检查等方法评价该模型的建立情况。(2)实验分组建模4周后随机分为5组(n=8),缺血心肌区域多点注射：MSCsAd.HGF组1×108个/ml MSCs; Ad.HGF组1×1010pfu200μl AdHGF; MSCs组1×108个/ml MSCs; AdNull组1×1010pfu200μl AdNull; control组Saline(生理盐水)1ml；(3)疗效评价：移植治疗4周后进行心功能检测,指标包括左室收缩容积(LVEDV)、左室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(FS)等；冠状动脉造影、SPECT心肌灌注检查等。处死动物,行心肌HE染色、免疫组化VIII因子检测、心肌TUNEL染色等；■结果：1、成功构建慢性缺血性心脏病模型,放置Ameroid环后,心肌运动减弱,心电图ST-T段变化明显。4周后超声证实模型左心搏动度明显降低,心室壁变薄,LVEF、FS值明显增加；2、治疗后4周,心脏彩超：MSCsAd.HGF组心功能较治疗前有明显改善,室壁厚度增加,心室腔减小,LVEDV有明显的缩小,EF、FS值较前有明显增加(P<0.05)；SPECT心肌灌注：MSCsAd.HGF组缺血区灌注改善,心肌厚度增加,运动增强(P<0.05)；DSA检查Rentorp评分：MSCsAd.HGF组侧枝循环较前形成明显增加(P<0.05)；心肌HGF蛋白表达：MSCsAd.HGF组HGF蛋白获得较高表达(P<0.05)；荧光显微镜：MSCsAd.HGF组见更多CM-DiI标记的移植细胞(P<0.05)；血管计数显示：MSCsAd.HGF组缺血边缘区内都有明显的血管新生,缺血边缘区多于缺血中心区(P<0.05)；Ⅷ因子检测：MSCsAd.HGF组出现大量Ⅷ因子阳性的血管,阳性血管率明显高于组AdNull组(P<0.05)；TUNEL染色：MSCsAd.HGF组较少棕黄色凋亡细胞,阳性率明显低于AdNull组(P<0.05)。■结论：◆MSCsAd.HGF移植可促进心肌局部再血管化,明显改善缺血心肌微循环,促进MSCs定植和存活；◆MSCsAd.HGF移植有效抑制心肌细胞凋亡和左室重构的发展,保护和改善心脏功能。◆MSCsAd.HGF移植较单纯AdHGF或MSCs移植治疗缺血性心脏病,改善心功能、抑制左室重塑的作用更明显。