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背景和目的: 肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种条件致病菌，主要感染糖尿病或恶性肿瘤等免疫功能低下或免疫缺陷的病人，其导致广泛的感染，包括肺炎，尿路感染，菌血症和脑膜炎等。根据致病特征及毒力特点，可将其分为两大类，即普通肺炎克雷伯菌（classic Klebsiella pneumoniae,cKP）和高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hvKP）。最近《柳叶刀感染病》（The Lancet Infectious Diseases）杂志报道了2016年在中国东南地区某医院，携带blaKPC-2的 ST11高毒力肺炎克雷伯菌院内爆发一文，该文引起广泛关注。经典的ST11碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌通过获得约170kb的pLVPK毒力质粒后，表现出高毒力。此研究表明一个惊人的进化事件：质粒介导的多重耐药和高毒力趋向在同一个主要流行的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌中进行克隆传播，如ST11。由于耐碳青霉烯的hvKP菌株可能在健康个体中引起严重的不可治愈的感染，所以这些菌株的出现对公众健康构成重大威胁。本次研究设计针对hvKP克隆以及流行的 ST11 碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）克隆的一个快速检测方法，用这个方法了解温州地区分子流行情况，研究高毒力碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌（HV-CRKP）毒力质粒的特征及主要流行的克隆分布；明确毒力基因与高黏液表型的关系，以及新型抗生素头孢他啶-阿维巴坦复合制剂对HV-CRKP的抑制效果。采用全基因组测序分析的水平进一步探索其分子进化。本研究覆盖了检测、治疗及分子进化三方面。 方法: 我们设计了三个多重PCR（PCR-I，II和III），PCR-I能够快速检测和鉴别流行性碳青霉烯耐药菌株的常见ST型，包括：ST258、ST11、 ST23、ST86和ST65菌株。PCR-II鉴别与ST23、ST86和ST65菌株相关的KL1及KL2以及ST11相关的KL47和KL64 K-loci分型。此外，PCRIII用于检测毒力质粒pLVKP携带的四种毒力基因和一个的复制子基因。我们使用设计的多重 PCR 方法回顾性筛选了 152 株临床肺炎克雷伯菌菌株。为了进一步探讨 KL64，KL47 是否携带pLVPK类似的毒力质粒，我们使用 GelJ软件分析S1-PFGE两者的质粒谱，明确两者之间质粒谱关系。通过Southern blot对rmpA基因进行定位。使用Illumina Nexseq 500 测序平台对定位到的质粒测序，进一步明确KL64，KL47是否携带pLVPK类似的毒力质粒，以及该质粒与pLVPK的区别。我们通过蜡螟幼虫感染模型以及血清杀伤试验来明确携带pLVPK类似的毒力质粒KL64，KL47菌株在毒力上的区别。最后我们使用肉汤稀释法检测 HV-CRKP 对头孢他啶 - 阿维巴坦的MIC。 结果: 通过对已知全基因组序列的76株肺炎克雷伯菌对多重PCR进行验证，结果显示与MLST以及WGS结果100％一致。在PCR-II中，肺炎克雷伯菌ST23分离株对应KL1为阳性，在174bp有特异性扩增条带。而ST86，ST65分离株KL2为阳性，在451bp有特异性扩增条带。 PCR-III用来检测与pLVKP类似的毒力质粒相关的4个毒力基因。 结果显示，ST23，ST65和ST86菌株均有5条特异性扩增条带，分别对应四个毒力基因（rmpA，rmpA2，iutA和iroN）和质粒复制子IncHIB。ST258菌株没有携带任何毒力基因。结果与WGS分析结果一致。我们使用设计的多重PCR方法回顾性筛选了152株临床肺炎克雷伯菌菌株。其中 104 株碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌株分离自住院患者，48 株肺炎克雷伯菌收集于临床门诊。ST11 型的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌对应的两种 KL 分型KL47、KL64都能够携带毒力质粒p-LVKP相关的毒力基因。 经S1核酸酶消化后，23株菌的 PFGE电泳图谱显示11 株 KL47 和12 株KL64的菌株中都存在2-3个质粒。进一步杂交显示，KL47 rmpA基因都定位在质粒上，大小近似，约~210kb。KL64 rmpA基因都定位在质粒上，~210kb，大小一样。与毒力质粒pLVPK（AY378100）进行了同源比对，所有23株ST11碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌全部携带与pLVK类似的质粒，该质粒与pLVPK质粒的大部分同源。通过系统进化树分析，中国现阶段分离的 ST11 常见的 KL 型为KL47和KL64。而欧美等地ST11的KL主要有KL24、KL15、KL27、KL24等。KL64和KL47属于两个不同的分支，这两种都能携带pLVPK类似的毒力质粒。 蜡螟幼虫感染模型，24小时后 KL64存活率约为45％， KL47存活率约为80％。7天后KL64存活率约为20％，KL47存活率约为45％。血清杀伤实验与人嗜中性粒细胞孵育3小时后，KL47存活率低于15％，KL64的存活率80％。 用肉汤稀释法检测 HV-CRKP 对头孢他啶 - 阿维巴坦的 MIC。结果显示携带碳青霉烯酶的菌株对头孢他啶耐药。 但是，当与阿维巴坦合用时，头孢他啶的MIC显着降低。头孢他啶-阿维巴坦和头孢他啶MIC50分别为0.5μg/ ml和128μg/ ml，头孢他啶-阿维巴坦的MIC90为1μg/ ml。加入4μg/ ml阿维巴坦后，头孢他啶对碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌的MIC90降低了256倍。 结论: 1. 我们首先发现了 KL64 携带 pLVPK 类似的毒力质粒。ST11 型HV-CRKP的KL可见于KL64和KL47，这两型分别可获得pLVPK类似的毒力质粒。 2. KL64 HV-CRKP的毒力比KL47 HV-CRKP高，如果只靠经典的粘液丝试验判断高毒力菌株，很有可能会漏检。 3. 头孢他啶-阿维巴坦对治疗携带KPC的高毒力肺炎克雷伯菌疗效好，具有应对迫切的满足的医疗需求的潜力。