论文部分内容阅读
蛇毒中富含各种作用于凝血系统诸多环节的蛋白酶和多肽，这些多肽和蛋白质在抗凝、抗血栓和止血等方面都有广泛的应用。本研究从中国产尖吻蝮蛇蛇毒中发现一分子量为31，400 dalton的抗凝活性蛋白组分，并对其理化性质和抗血栓活性作用进行了研究。 根据实验目的，本研究的实验分为两个部分： 1、尖吻蝮蛇毒中抗凝组分acoagulatin的纯化鉴定及其理化性质的研究 采用DEAE-Sepharose Fast Flow和CM-sepharose Fast Flow两种离子交换柱层析对尖吻蝮蛇蛇毒进行了分离纯化。经DEAE-Sepharose Fast Flow分离后，收集Ⅰ—Ⅻ号洗脱峰的各组分，分别将各组分通过小鼠静脉注射给药，用剪尾法测定小鼠尾静脉出血时间，并将各个组分分别注射小鼠背部皮肤观察是否有出血毒性。实验结果表明，所收集的Ⅲ号峰组分可以显著延长小鼠静脉出血时间，同时无出血毒性，即对Ⅲ峰做进一步分离纯化。 将Ⅲ峰加入CM-sepharose Fast Flow层析柱中，进行梯度洗脱，收集分离纯化出的Ⅰ—Ⅳ号峰的各组分，分别将所收集的各组分小鼠静脉注射，剪尾法测定出血时间，并分别注射小鼠背部皮肤观察有无出血毒性，同时对收集各组分进行类凝血酶活性测定，另外将20μl PT加入到20μl抗凝全血中，对各组分进行抗凝活性测定，持续观察1小时，通过观察血液是否凝固而确定该组分是否具有抗凝作用，发现其中Ⅰ号峰既能延长小鼠出血时间及PT，又无明显的出血毒性和类凝血酶活性，是一种安全、有效的无类凝血酶活性的尖吻蝮蛇蛇毒抗凝组分，即收集Ⅰ号峰备用。 经过DEAE-Sepharose Fast Flow和CM-sepharose Fast Flow两步分离纯化，成功地纯化出这一新的抗凝组分，并命名为acoagulatin。 为了进一步鉴定该组分的纯度，经高效液相色谱(HPLC)进行纯度鉴定，结果显示其为一对称单峰，主成分相对百分含量为95.30％，具第一军医大学硕士学位论文有较高的纯度。同时采用SDS一PAGE电泳对acoagulatin进行分子量测定 (5%浓缩胶，pH6.8，12%分离胶，pHS.8，电极缓冲液为pHS.3的Tris一甘氨酸缓冲液)，凝胶结果显示:测得该种物质的分子量为31，400dalton，由两个亚基组成，分子量分别为14，400 dalton和17，000 dalton。用Bradford法得到目的蛋白(即aco眼ulatin)的蛋白含量为0.265mg/ml。 2、尖吻蝮蛇毒中抗凝组分acoagulatin的抗血栓活性研究 在acoagulatin的抗血栓研究中，我们主要进行了体外实验和动物体内实验。 一、体外实验 (l)、体外抗凝实验:TT、PT、APTT 将浓度为0.30陀尔l、0.20林g尔l、0.15林g/林l的aco昭ulatin的溶液20川在体外分别与10即1抗凝兔血浆混匀，在LBY一NJ型血凝仪进行抗凝实验，结果表明acoagulatin对反映内、外源凝血活性的PT、AP竹均有显著的延长作用，但对TT没有影响。 (2)、纤溶活性测定:水解纤维蛋白原电泳、纤维蛋白平板实验 为了观察acoagulatin是否具有纤溶性，进行水解纤维蛋白原电泳和纤维蛋白平板实验，结果表明acoagulatin不论是对24小时后的纤维蛋白平板还是水解纤维蛋白原电泳都无影响，说明该抗凝组分acoagulatin不具有纤溶性，同时也不能在体外水解纤维蛋白原。 (3)、体外血小板聚集实验 将浓度为0.30雌尔l、0.20林g小l、0.15林g尔l的aco鲍ulatin的溶液20川在体外分别与9闪或12川的ADP或者胶原混匀，在SPA一4血小板凝集仪上进行acoagulatin抗ADP和胶原诱导的血小板聚集实验。结果表明acoagulatin对血小板聚集没有显著的拮抗作用。 二、动物实验: (l)、抗大鼠静脉血栓实验: Acoagulatin体内给药(35.78林g/kg)，即可明显的减少大鼠腹腔静脉血栓的湿重和干重，有效地抑制静脉血栓的形成。 (2)、抗家兔动脉血栓实验: 抗凝组分acoagulatin 530林g/kg、265陀/kg两个剂量家兔耳缘静脉给第一军医大学硕士学位论文药，能显著地抑制家兔颈动脉血栓的形成。 ③、全血凝固时间实验(CT): Acoa沙latin 26·5林g/109·13.3卜g/109、10.6林g/109三个剂量小鼠鼠尾静脉给药，可以显著延长小鼠眼球后静脉的凝血时间。 Aeoagulatin 265林g/kg、1 33协g/kg、66“g/kg三个剂量家兔耳缘静脉给药，可以在30分钟到6小时之间有效的延长家兔耳中央动脉的凝血时间。 (4)、出血毒性实验: 通过小鼠背部皮下注射ac。眼ulatin(0 .265mg加l)0.2ml，观察无明显的出血毒性反应，说明acoagulatin是一种具有一定安全性的蛇毒抗凝组分。 (5)、小鼠鼠尾出血时间(BT): Aeo眼ulatin分别按照2.65mg/kg、2.12 mg/kg、1.06 mg/kg剂量小鼠尾静脉给药，剪尾法测定小鼠鼠尾静脉的出血时间，发现2.65mg/kg、2.12mg/kg两个剂量组可以有效的延长小鼠尾静脉的出血时间。 上述结果表明，湖南产尖吻蝮蛇毒冻干粉经过DEAE一SePharose FastFlow和CM一sePharose Fast Flow离子交换柱层析，获得的抗凝组分acoagulatin是一种单纯的、由两个亚基组成的的较大分子量的抗凝组分，其分子量为31，400dalton，它的蛋白含量为0.265mg/ml。它不具有纤溶性也不能在体外水解纤维