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研究目的：
本实验在先前已有的研究基础上，通过对表达rhOP-1工程菌的发酵条件的优化，拟建立一种稳定、高效的发酵工艺。为获得高纯度、有活性的目的蛋白，在对rhOP-1纯化后进一步比较影响rhOP-1复性的因素，确定最佳复性条件，并初步探索疏水色谱法一步纯化和复性，提高复性效率。同时采用体外、体内两种方法测定大肠杆菌表达的rhOP-1生物学活性，拟建立rhOP-1活性测定的标准并为其质量控制和临床应用提供实验依据。
研究方法：
1.对表达rhOP-1的工程菌进行摇瓶培养，摸索不同菌种、培养基、pH值、接种量、诱导时机、诱导时间等对目的蛋白表达量的影响。放大至发酵罐30℃培养，通过调节转速和通气量使培养基溶氧保持在20％以上，利用2mol/LNaOH和1mol/LHCl调节pH值，补充氮源和碳源，待菌液OD600在1.2～1.5范围内时，迅速升温诱导表达，诱导4h后，收集菌体。Westernblot鉴定目的蛋白rhOP-1,并比较不同发酵批次的重复性，检测多次传代后的工程菌的稳定性。
2.超声裂解收集的菌体，经多次洗涤后收集包涵体，用高浓度的变性剂溶解包涵体。利用离子交换法和疏水色谱等方法对rhOP-1进行层析纯化，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度；通过改变温度、pH值以及添加一些促复性剂对rhOP-1进行复性，Totallab软件分析分析蛋白纯度和二聚体含量。通过对包涵体蛋白先透析复性，在低浓度变性剂的条件下纯化目的蛋白，并尝试疏水色谱法对rhOP-1复性，以提高复行效率。
3.比较rhOP-1对不同细胞生长的影响，筛选一种敏感的细胞株作为体外活性测定的效应细胞，采用改良MTT、PNPP和RT-PCR等方法检测rhOP-1对效应细胞增殖、ALP活性和基因表达的影响，同时通过小鼠肌袋埋植实验观察植入rhOP-1埋植剂后的组织病理切片和钙含量的变化，检测其体内活性。
研究结果：
1.表达rhOP-1的工程菌经发酵培养后OD600nm达10.0左右，每升培养液可获得20g左右菌体，目的蛋白表达量占菌体蛋白的30％以上。多次传代后经SDS-PAGE、酶切鉴定、测序分析表明工程菌菌种遗传稳定，Westernblot鉴定表明所表达的外源蛋白即为目的蛋白rhOP-1。
2.经过包涵体洗涤和纯化后rhOP-1纯度可达98％以上。确定了在低温(4℃)、pH9.0条件下并添加0.2mol/LL-Arg和3mmol/LGSH、0.3mmol/LGSSG的复合复性缓冲液对rhOP-1复性效果较好。疏水复性获得的rhOP-1二聚体含量在50％左右，但有部分蛋白沉淀在介质上，需要进一步改进条件。
3.NIH3T3细胞可作为rhOP-1体外测活的靶细胞，体外活性测定结果显示rhOP-1在一定浓度范围内，实验组细胞增殖数、碱性磷酸酶水平和骨钙素mRNA表达水平明显高于阴性对照组。在体内rhOP-1埋植剂植入小鼠肌间隙两周后，与对照组相比可以提高钙含量，并且有明显的成骨趋势。
结论：
建立了稳定、高效的工程菌的发酵工艺，rhOP-1经过纯化、复性后具有良好的生物学活性。NIH3T3细胞作为rhOP-1的效应细胞在体外检测rhOP-1活性具有较好的重复性和灵敏性，确定了大肠杆菌表达rhOP-1的生物学活性测定的方法。