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目的采用基因重组及蛋白原核表达技术获取抗CD40×HER2双特异性单链抗体(CD40×HER2 Single chain Diabody,CD40×HER2 Sc Db),并检测其激活肿瘤特异性免疫及HER2分子靶向的功能。方法使用固相筛选法对抗CD40噬菌体展示免疫文库进行筛选,并通过噬菌体ELISA最终筛选获取高亲和力抗CD40 Sc Fv克隆。以此为模板,PCR扩增获取CD40 Sc Fv的重链可变区(heavy chain variable,VH)及轻链可变区(light chain variable,VL)序列,通过重叠PCR(Overlap Extension OE-PCR)将CD40 Sc Fv的VH及VL分两步与HER2 Sc Fv基因片段进行拼接获取CD40×HER2 Sc Db序列全长,DNA电泳及测序检测拼接序列的正确性。使用Nde I及Sal I进行CD40×HER2Sc Db序列及p ET28a原核表达载体的酶切并构建p ET28a-CD40×HER2 Sc Db原核表达载体。将构建的重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,超声裂解诱导菌体,Ni-NTA琼脂糖纯化获取CD40×HER2 Sc Db,并对其进行理化性质的分析及分子结构预测。体外诱导培养小鼠骨髓源树突状细胞,流式细胞术检测CD40×HER2 Sc Db对树突状细胞表面CD80/CD86及MHC-II表达的影响。依据给予的干预不同,实验分为:生理盐水(Normal Saline,NS)对照组;单纯肿瘤抗原负载(Ag)组;Ag+CD40×HER2 Sc Db组以及Ag+TNF-α组4组。ELISA检测CD40×HER2 Sc Db对树突状细胞分泌IL-12的影响以及对T淋巴细胞分泌IFN-γ的影响。体外培养小鼠乳腺癌细胞系4T1,CCK8检测CD40×HER2 Sc Db诱导的肿瘤特异性T淋巴细胞对4T1增殖的抑制作用。构建4T1细胞系的BALB/c小鼠肿瘤模型,依据给予的不同干预,将模型小鼠随机分为:NS组;HER2 Sc Fv组;CD40×HER2 Sc Db1组(750μg/kg);CD40×HER2 Sc Db2组(1.5mg/kg)及CD40m Ab(5mg/kg)组。记录并描绘各组肿瘤生长曲线,ELISA检测肿瘤组织中IL-12、IFN-γ的表达水平。对肿瘤组织进行石蜡包埋切片,HE染色检测肿瘤组织淋巴细胞浸润,免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测肿瘤细胞Caspase-3的表达水平。体外培养小鼠成纤维瘤细胞系T6-17细胞系,细胞免疫荧光检测CD40×HER2 Sc Db对HER2的靶向功能,CCK8实验检测CD40×HER2 Sc Db对T6-17细胞的体外杀伤。依据给予的干预不同,实验分组为:NS组;CD40 Sc Fv组(2.5μg/m L);HER2 Sc Fv组(2.5μg/m L);CD40×HER2Sc Db1组(2.5μg/m L);CD40×HER2 Sc Db2组(5μg/m L);曲妥珠单抗组(15μg/m L)。 构建T6-17细胞的BALB/c-Nude小鼠肿瘤模型,依据给予的干预不同,将模型小鼠随机分为:NS组;CD40 Sc Fv组(150μg/kg);HER2 Sc Fv组(150μg/kg);CD40×HER2 Sc Db1组(150μg/kg);CD40×HER2 Sc Db2组(300μg/kg);曲妥珠单抗组(1mg/kg)。记录小鼠皮下肿瘤的体积的变化,对肿瘤组织进行石蜡包埋并切片,HE染色观察T6-17肿瘤组织细胞形态的变化。结果固相筛选法对噬菌体展示文库克隆的序列多样性发挥了收敛效果。第三轮筛选克隆的测序结果100%匹配的克隆占总克隆数的3.2%,并筛选获取了8个潜在阳性克隆,梯度噬菌体ELISA检测各潜在克隆的亲和力表明,8#克隆与CD40的亲和力最佳,其与BSA亲和力的比值>3,符合阳性克隆筛选的标准。PCR扩增CD40 Sc Fv的VH及VL片段,DNA电泳及测序结果表明CD40 Sc Fv的VH及VL碱基长度分别为345bp及324bp,与预期大小相符,重叠PCR拼接获取的CD40×HER2 Sc Db基因序列长度为1464bp,与预期相符。使用0.5mmol/L IPTG可获得最佳蛋白诱导效果,蛋白变性电泳结果可于55Kd左右见一明显条带,其大小与预期相符,对His-tag进行Western Blot检测同样可于55Kd左右见一明显条带,BCA检测纯化后蛋白浓度为2.7mg/ml。流式细胞术检测Ag+CD40×HER2Sc Db组DC表面CD80、CD86及MHC-II的表达率分别为93.5±3.1%86.00±3.2%92.3±2.8%,与Ag+TNF-α组相比,差异无统计学意义(P>0.05),与NS组及Ag组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测Ag+CD40×HER2 Sc Db组DC细胞上清中的IL-12浓度为659.90±61.28 pg/m L,与Ag+TNF-α组相比,差异无统计学意义(P>0.05),与NS组及Ag组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。Ag+CD40×HER2 Sc Db组T淋巴细胞对4T1细胞增殖的抑制率为75.65±2.53%,与Ag+TNF-α组相比,差异无统计学意义(P>0.05),与Ag组及NS组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测CD40×HER2 Sc Db2组4T1肿瘤组织内IL-12及IFN-γ表达水平分别为448.85±51.10 pg/m L,273.44±44.60 pg/m L,与NS组及HER2 Sc Fv组相比,差异有统计学意义(P<0.05),与CD40 m Ab组相比,无统计学差异(P>0.05)。观察不同组小鼠4T1肿瘤体积的变化表明,CD40×HER2 Sc Db2组(1.5mg/kg)及CD40 m Ab(5mg/kg)均可显著抑制4T1肿瘤的体内增殖,二者的抑制效果无统计学差异(P>0.05)。免疫组化检测肿瘤组织Cleaved-Caspase-3的表达水平,结果表明,CD40×HER2Sc Db组4T1肿瘤细胞内Cleaved-Caspase-3的表达显著上调。CCK8检测CD40×HER2 Sc Db对T6-17细胞增殖的抑制结果表明,CD40×HER2 Sc Db(5μg/m L)对T6-17的抑制率为86.89±6.35%,其与曲妥珠单抗(15μg/m L)的抑制率85.56±1.73%相比,差异无统计学意义(P>0.05)。Western Blot检测不同干预组Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2的表达水平,结果表明,CD40×HER2Sc Db、HER-2 Sc Fv及曲妥珠单抗均可抑制Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2的表达,与NS组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。小鼠肿瘤组织HE染色结果表明,NS组细胞形态正常,细胞核完整,部分细胞可见核仁,细胞生长活跃,CD40×HER2 Sc Db和曲妥珠单抗组肿瘤组织细胞失去正常形态,核固缩核碎裂现象明显。结论通过对抗CD40噬菌体展示免疫文库的筛选,可成功获取抗CD40高亲和力单链抗体克隆。通过重叠PCR可成功获取CD40×HER2 Sc Db基因序列全长,通过IPTG诱导可成功于原核蛋白表达系统表达获取CD40×HER2 Sc Db蛋白,并通过蛋白复性获得功能性蛋白。CD40×HER2 Sc Db可通过促进DC细胞成熟,激活肿瘤特异性免疫,体外杀伤肿瘤,也可通过促进肿瘤特异性CTL在肿瘤组织巢集,通过激活肿瘤细胞内Caspase-3诱导肿瘤细胞凋亡,并通过上调组织内激活型免疫细胞因子激活肿瘤特异性免疫反应。CD40×HER2 Sc Db可通过与T6-17表面的HER2结合,抑制Akt、ERK1/2的磷酸化,抑制T6-17的体外增殖,同时也可在体内通过HER2靶向功能抑制T6-17细胞的增殖。