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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）分子水平的研究起始于20世纪80年代初,研究显示AD是一种与年龄相关的神经退行性疾病,其特征体现在:胆碱能神经的退化和记忆力逐渐丧失。AD的最突出的两种组织病理学生物标志物包括以β-淀粉样蛋白(β-amyloid1-42,Aβ1-42)为主的聚合物形成的细胞外异常聚集的淀粉样斑块,以及由过度磷酸化的Tau蛋白质形成的细胞内的神经纤维缠结（NFTs）。Aβ1-42合成异常、Aβ1-42代谢水平降低和Aβ1-42转运失衡都导致Aβ1-42发生异常聚集,引起Tau蛋白的过度磷酸化,同时观察到脑内突触和微管的数量减少。Aβ1-42由于自身的缔合在体内存在多种聚合态,包括单体（Aβ-M）、二聚体（Aβ-D）、寡聚体（Aβ-O）和多聚体（Aβ-P）。早期的研究认为主要是Aβ-O在发挥作用,近年来有研究侧重于Aβ-D的作用,Aβ-M作为Aβ多种聚合态的最小结构单元却很少被报道。有研究表明Aβ-M在正常的神经细胞内具有保护作用。课题组成员在Journal of Biological Chemistry报道了可溶性Aβ1-42可在原代神经细胞中引起Tau蛋白的多个位点磷酸化,敲除β2肾上腺素受体（β2AR）基因可以降低可溶性Tau蛋白磷酸化并逆转转基因AD动物模型前皮质神经元树突棘的减少。在我们尚未发表的研究中,发现Aβ-M引起Tau的Ser-214位点的磷酸化的作用最为强烈。临床研究报道亦表明β2AR拮抗剂可能改善AD患者的学习记忆。AD患者最早出现Aβ淀粉样斑块的前额叶皮质和海马中β2AR的数量明显增加。长期β2AR激动剂刺激可增强γ-分泌酶活性,增加Aβ产生以及Aβ老年斑块的形成。在本课题组前期研究以及其它研究报导基础上,本研究利用分子生物学、细胞生物学、生物化学和FPLC等方法旨在了解Aβ-M的生物学功能及β2受体介导Aβ-M的信号传导;利用DNA微阵列技术,研究β2AR在双转基因的阿尔兹海默病小鼠模型内对其基因组表达的影响。其结果对于理解阿尔茨海默病发生机理以及寻找防治该病的药物作用靶点有较大意义。结果如下所示:1.将构建好的pcDNA3.1-Aβ-Halo和pcDNA3.1-Halo载体转染进神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,转染后细胞蛋白通过Western blot检测,Aβ-Halo和Halo蛋白真核表达,没有多聚体产生。转染Aβ-Halo的细胞在48h后几乎全部死亡,而Halo蛋白转染后细胞存活无明显影响,说明Aβ-Halo蛋白中Aβ-M发挥作用导致细胞死亡。经细胞凋亡与坏死试剂盒检测发现,Aβ-M能诱导细胞发生凋亡。q PCR实验发现促凋亡因子Bax和Bid基因表达水平对比正常细胞上调,而抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-x L基因表达水平下调,从而进一步说明Aβ-M能够诱导细胞凋亡。2.酵母双杂交实验发现Aβ-M与β2AR存在蛋白质相互作用。而后将构建好的p ET41b-Aβ-His和p ET41b-Aβ42-1-His载体转入大肠杆菌中表达纯化,将纯化后蛋白与SH-SY5Y的细胞裂解液进行孵育,收集Pulldown后的蛋白洗脱液。Aβ-His组和Aβ42-1-His对照组的蛋白洗脱液用β2AR一抗做Western blot,Aβ-His组检测出目的条带,证明Aβ-M与β2AR存在蛋白质相互作用。3.在低温条件下,用FPLC方法从Aβ溶液中分离出Aβ-P、Aβ-O、Aβ-D和Aβ-M;用新鲜分离到的不同聚合态的Aβ分别刺激SH-SY5Y细胞,然后分别用Tau（Ser-214）、JNK（Thr-183/Tyr-185）和p70S6K（Thr-389）一抗做Western blot检测,结果表明:Aβ-M能引起Tau的Ser-214,JNK的Thr-183/Tyr-185和p70S6K的Thr-389位点的磷酸化。4.分别用β1AR抑制剂CGP 20712(10-6M)、β2AR抑制剂ICI 118551(10-6M)、蛋白激酶A（PKA）抑制剂myristoylated PKI(10-5M)、丝裂原活化蛋白激酶（MEK）抑制剂PD 0325901(2×10-7M)、c-Jun氨基末端激酶（JNK）抑制剂SP 600125(2×10-7M)、c AMP激活的交换蛋白（Epac）抑制剂ESI 09(5×10-6M)和G蛋白偶联受体激酶（GRK2）抑制剂βARKct对SH-SY5Y细胞进行预处理,然后用Aβ-M刺激,再分别用Tau（Ser-214）、JNK（Thr-183/Tyr-185）和p70S6K（Thr-389）一抗做Western检测,结果表明:Aβ-M引起Tau蛋白Ser-214磷酸化的作用主要由β2AR-PKA-JNK和β2AR-GRK2细胞信号传导通路介导。β2AR和β1AR不参与MEK介导的Aβ-M引起p70S6K磷酸化的作用5.取PS1/APP以及β2AR-KO/PS1/APP小鼠大脑半侧,用RNeasy脂质组织试剂盒进行总RNA提取,利用DNA微阵列技术研究β2AR敲除后对双转基因AD小鼠模型基因组表达的影响。结果表明:其影响涉及蛋白质加工与递呈,包括膜结构和MHC I类和II类蛋白质复合物;还涉及蛋白质降解组件,包括溶酶体和水解酶的活性。综上所述:Aβ-M蛋白能诱导SH-SY5Y细胞凋亡;β2AR介导Aβ-M引起JNK和Tau蛋白磷酸化的作用;Aβ-M引起Tau蛋白Ser-214位点的磷酸化的作用主要由β2AR-PKA-JNK和β2AR-GRK2细胞信号传导通路介导;β2AR和β1AR不参与MEK介导的Aβ-M引起p70S6K蛋白的Thr-389位点的磷酸化的作用。敲除β2AR基因对AD双转基因动物模型基因组表达的影响包括:对蛋白质加工与递呈的影响,包括膜结构和MHC I类和II类蛋白质复合物;对蛋白质降解组件的影响,包括溶酶体和水解酶的活性。Aβ-M作为Aβ多种聚合态的最小单元,β2AR作为与AD相关的细胞膜表面受体,它们的生物学功能还需进一步的研究,其研究结果对于理解阿尔茨海默病机理研究及疾病防治可能有重要意义。