目的慢性锰中毒主要作用于大脑纹状体苍白球和黑质网状带,引起该部位的多巴胺能神经损伤,多巴胺（dopamine,DA）生成减少,并导致锥体外系功能失调。体内和体外实验揭示锰可能是一种多巴胺能神经毒素。对于锰神经毒作用的机制,许多学者己经从氧化应激、巯基耗竭、能量代谢、DA自氧化、线粒体损伤、泛素-蛋白酶体功能障碍、兴奋性毒性等多方面进行了研究。多数学者把锰的神经毒性与帕金森病（Parkinson’s disease,PD）联系起来,因为慢性锰中毒可出现类似PD样锥体外系神经受损症状,如精神改变,动作失调、肌张力增高和震颤等锥体外系症状,且慢性锰中毒患者左旋多巴治疗有效,说明锰的毒性作用机制可能与多巴胺能神经元的缺损有关。PD的病因迄今不完全清楚,学者们试图从遗传和环境角度来阐明PD的病因和发病机制,目前普遍认为PD的发生可能是遗传因素和环境因素共同作用的结果。基于流行病学研究,某些金属（如锰、铅、铝等）慢性职业暴露可能是PD的环境危险因素之一。氧化应激在某些中枢神经系统退行性疾病,如PD、阿尔兹海默病（Alzheimer’sdisease,AD）等的发病机制中发挥着重要的作用。多巴胺能神经元的退行性变以及多巴胺能神经递质产生的减少是PD等神经系统变性疾病发病机制中的关键环节,而在脑部的各种神经元中,多巴胺能神经元对各种氧化应激尤其敏感,这是由于在DA的代谢过程中均伴随着大量自由基的生成。细胞内自由基产生的重要来源之一为线粒体的电子传递链。有证据表明,当黑质区域线粒体中存在电子传递链功能的异常,尤其线粒体复合物Ⅰ功能异常时,可促进自由基生成。当线粒体复合物Ⅰ的活性受到抑制时,神经末梢的线粒体更容易受到H₂O₂等引起的氧化应激损害。锰作为一种过渡元素,可通过血脑屏障,容易在大脑黑质区域蓄积,并通过对电子传递链的作用引起DA的自氧化,生成具有毒性的自由基。DA氧化代谢过程中产生H₂O₂以及超氧阴离子,在黑质部位Fe³⁺催化下可生成各种自由基,促进了氧化应激反应。因此研究者们推测PD的发生正是由于自由基的产生与清除之间正常的平衡受到了严重的破坏,最终导致了DA神经元死亡。有研究发现,α-突触核蛋白（a-synuclein,α-syn）与PD、AD等神经系统退行性疾病的发病机制有关。α-Syn为1988年Maroteaux等在用纯化的抗突触囊泡的抗血清从电鳗体内表达筛选cDNA文库时得到的一种新蛋白质,后被证实为人类AD淀粉样斑块中非Aβ蛋白的前体蛋白,脊椎动物的α-syn高度保守。自从发现其与神经系统变性疾病病理过程相关联,越来越多的实验试图揭示α-syn的生理功能及其在神经系统变性疾病中的作用机制。目前,关于这种蛋白的生理功能还不清楚,有研究提示该蛋白对于神经突触前膜中的突触囊泡具有调节作用,另有研究显示α-syn与神经元的突触可塑性及学习记忆功能有关。在一些细胞中,α-syn过表达对细胞具有保护作用,而在其他不同的细胞中则正好相反。目前普遍认为α-syn过表达对多巴胺能神经细胞是具有毒性作用的。有研究显示α-syn的过表达可诱导细胞凋亡。过去的几年中,许多研究证实α-syn在Lewy小体病和PD的发病机制中起到了关键的作用,然而α-syn在锰神经毒性作用中的机制尚不清楚。有证据表明,α-syn可能是联系PD和重金属中毒的分子桥梁:过表达的α-syn可减低蛋白酶体的活性,降低细胞对蛋白酶体抑制的耐受性,引起线粒体损害和细胞凋亡;过表达的α-syn可抑制黑质多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶的活性并进一步损害细胞;另外,过表达的α-syn还可增加神经元对氧和自由基毒性的易感性,同样会导致细胞的凋亡。但也有研究证实α-syn基因的低表达是引起PD患者神经细胞凋亡的原因。基于以往的实验事实,我们以人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y为实验模型,研究锰对多巴胺能神经细胞的毒性作用,筛选锰引起SH-SY5Y细胞增殖抑制及细胞凋亡的时间及剂量关系,探讨在此过程中α-syn蛋白表达水平的变化及其引起细胞毒性的可能机制,旨在寻找锰等PD相关环境危险因子对大脑纹状体和黑质损伤作用的分子机制,以期揭示锰中毒等神经退行性疾病的病因学基础,为临床预防和治疗锰中毒及其他神经系统退行性疾病提供一定的实验依据。方法1、通过噻唑蓝（MTT）比色实验检测细胞的增殖情况,并绘制细胞生长曲线,筛选锰的细胞毒性剂量。2、通过SOD试剂盒及MDA试剂盒检测锰对SH-SY5Y细胞氧化应激水平的影响。3、通过分别转染senseα-syn和anti-senseα-syn基因改变SH-SY5Y细胞α-syn表达水平。4、通过RT-PCR法、Western blot法检测α-syn mRNA及蛋白表达水平的变化。5、通过caspase-3试剂盒和流式细胞术检测锰对SH-SY5Y细胞凋亡水平的影响。结果1、锰对SH-SY5Y细胞增殖的影响:MTT检测结果显示,100～900μmol/L MnCl₂作用3～48 h对SH-SY5Y细胞的增殖有不同的抑制作用,且随锰浓度的增高及其作用时间的延长,抑制作用越来越明显。2、染锰对SH-SY5Y细胞氧化应激水平的影响:（1）500μmol/L MnCl₂作用6、9、12、18 h均可显著降低SH-SY5Y细胞SOD活性,且这种抑制作用随着锰作用时间的延长越来越明显。（2）500μmol/L MnCl₂作用6、9、12、18 h均可显著增加SH-SY5Y细胞中MDA含量,且MDA含量的增加随着锰作用时间的延长越来越明显。3、调整α-syn表达水平对SH-SY5Y细胞氧化应激水平的影响:（1）通过转染senseα-syn基因提高染锰SH-SY5Y细胞α-syn表达水平对细胞SOD活性及MDA含量没有显著影响。（2）通过转染anti-senseα-syn基因降低染锰SH-SY5Y细胞α-syn表达水平对细胞SOD活性及MDA含量没有显著影响。4、染锰对SH-SY5Y细胞α-syn mRNA和蛋白表达水平的影响:（1）RT-PCR结果显示,500μmol/L MnCl₂作用9 h即可检测到α-synmRNA表达水平的显著升高。（2）Western blot结果显示染锰12 h可检测到α-syn蛋白表达水平的显著升高。5、改变染锰SH-SY5Y细胞氧化应激水平对细胞α-syn mRNA和蛋白表达水平的影响:（1）抑制染锰SH-SY5Y细胞氧化应激反应（10 mmol/L维生素C预处理）可显著减少α-syn mRNA及蛋白表达水平。（2）促进染锰SH-SY5Y细胞氧化应激反应（200μmol/L H₂O₂预处理）可显著增加α-syn mRNA及蛋白表达水平。6、染锰对SH-SY5Y细胞凋亡的影响:（1）500μmol/L MnCl₂作用12、18 h能明显诱导SH-SY5Y细胞caspase-3活化。（2）流式细胞术结果显示,500μmol/L MnCl₂作用12、18 h可引起Annexin V阳性细胞数显著高于对照组。7、改变氧化应激反应对SH-SY5Y细胞凋亡的影响:（1）抑制染锰细胞氧化应激反应（1O mmol/L维生素C预处理）对caspase-3活性的升高具有显著的抑制作用;促进染锰细胞氧化应激反应（200μmol/L H₂O₂预处理）可促进caspase-3的活化。（2）与染锰组相比,通过10 mmol/L维生素C预处理抑制染锰细胞氧化应激反应可明显减少Annexin V阳性细胞数;200μmol/L H₂O₂预处理促进染锰细胞氧化应激反应可显著增加Annexin V阳性细胞数。8、调整α-syn蛋白表达量对SH-SY5Y细胞凋亡的影响:（1）通过转染senseα-syn基因提高染锰SH-SY5Y细胞α-syn蛋白表达量可显著提高caspase-3的活性;通过转染anti-senseα-syn基因降低染锰SH-SY5Y细胞α-syn蛋白表达水平则抑制了caspase-3的活化。（2）通过转染senseα-syn基因提高染锰SH-SY5Y细胞α-syn蛋白表达量可显著增加Annexin V阳性细胞数;而转染anti-senseα-syn基因则减少了Annexin V阳性细胞数。结论1、一定浓度的锰可显著抑制SH-SY5Y细胞增殖,促进细胞氧化应激及α-syn mRNA及蛋白表达量增加,并可诱导细胞凋亡。2、改变染锰SH-SY5Y细胞的氧化应激水平可影响α-syn的表达量,而调整α-syn的表达量对细胞氧化应激水平没有显著影响,提示氧化应激反应对α-syn的表达量的影响可能是单方面的。3、α-Syn表达量的增加对SH-SY5Y细胞的凋亡具有促进作用;相反,α-syn表达水平的降低对SH-SY5Y细胞的凋亡具有抑制作用,提示诱导α-syn表达量的增加可能在MnCl₂引起的多巴胺能神经细胞凋亡中起重要作用。4、锰毒性作用的分子机制可能是通过氧化应激诱导α-syn表达水平升高,最终促进了细胞的凋亡。