菊花病毒鉴定及茎尖培养脱毒方法研究

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菊花(Chrysanthemum×morifolium)原产我国,是我国十大传统名花和世界四大切花之一,具有重要的观赏价值和经济价值,在生产和园林应用中占有十分重要的地位。然而,菊花采取无性繁殖,极易受到病毒、类病毒的危害。菊花一旦感染病毒,则终身带毒,造成持久性的危害,最终导致菊花种性的退化,病毒却随着菊花繁殖系数的增加而加快传播扩散;菊花受病毒侵染后出现花叶、斑驳、畸形、矮化等症状,导致观赏性状下降;有些病毒侵染菊花后,并不呈现症状,却随着植株的生长而植株体内逐渐积累,导致菊花种性退化;此外,由于环境的作用和田间管理不科学,菊花容易受到几种病毒的复合感染。目前,对于菊花病毒病的防治尚无有效的化学药剂,因此,要建立一种灵敏、快速、可靠的病毒鉴定方法,确定病毒种类,及时将病株隔离,防止病毒(类病毒)的扩散,同时,使用简单、高效的脱毒技术,改善菊花品质,恢复菊花种性。本研究以田间染病的菊花为材料,研究病毒的鉴定和脱毒方法。主要研究结果如下:(1)运用DAS-ELISA检测CVB和TAV两种病毒,通过设计四种病毒的引物,运用单重RT-PCR方法鉴定CVB、TAV病毒和CChMVd、CSVd等类病毒。实验证明DAS-ELISA方法可以检测病毒,而RT-PCR方法不仅可以检测病毒,还可以检测类病毒,检测范围更广。(2)在单重RT-PCR的基础上,通过对四对病毒引物浓度进行优化,建立了一种可以同时检测CVB、TAV、CSVd和CChMVd的多重RT-PCR体系,并运用该方法鉴定了自然条件下的病毒侵染情况,从而建立了一种同时检测两种或两种以上的病毒多重RT-PCR方法。(3)进行了DAS-ELISA和RT-PCR方法的灵敏度比较试验,结果表明,RT-PCR方法的检测的灵敏度可达pg级,是DAS-ELISA方法的100倍。(4)分别切取<0.3mm,0.3-0.7mm,0.7-1.0m的菊花茎尖和使用二次茎尖培养法对菊花茎尖进行脱毒培养,并结合RT-PCR方法检测脱毒效果,结果证明,结果表明,当茎尖长度<0.3mm时,茎尖成活率仅为6%,而脱毒效果为66.6%;当茎尖长度为0.3-0.7mm时,茎尖成活率为75%,脱毒率为22.8%,当茎尖长度为0.7-1.Omm时,茎尖成活率可达90%,但是脱毒率为6%;运用二次茎尖培养法进行培养,茎尖成活率为60%,脱毒率可达43.3%,获得的脱毒苗数目均高于一次茎尖培养法。
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