红曲菌,又称红曲霉(Monascus spp.),是我国传统的食药两用丝状真菌,其发酵产物——红曲,广泛应用于我国食品及医药保健品等领域。红曲菌可产生红曲色素(Monascus pigments,Mps)、莫纳可林、麦角固醇和桔霉素等多种次级代谢产物。其中Mps是红曲菌的主要次生代谢产物之一,为混合物,包括黄、橙、红三类色素,目前已鉴定结构的Mps组分多达90余种。Mps不仅可作为天然的食品着色剂,同时还具有降血脂、降血压和降血糖等功效。目前,我国的Mps产品主要包括固态发酵的红曲米和液态发酵的红曲红、红曲黄,共3种。其中,红曲米的生产技术成熟、环境污染少,但存在生产过程中易被杂菌污染、自动化程度低、劳动强度大及在应用中着色不均匀等不足。而液态发酵自动化程度高、不易染杂菌、产品应用方便、着色均匀,所以液态发酵生产的红曲红和红曲黄正成为我国的主要Mps产品品种。目前我国液态Mps产品生产的基本工艺是,先过滤发酵液得到菌丝体,然后再以酒精提取菌丝体的胞内Mps,而发酵上清液中的胞外Mps通常作为废水而丢弃,造成很大的浪费并增加了环保压力。因此,如何提高胞内Mps的含量,减少胞外Mps的含量是迫切需要解决的问题。为此,研究者从菌种选育、发酵工艺等方面开展了很多研究,但效果均不很理想。从分子水平上研究红曲菌中Mps的转运和分泌机制,可望为构建高产胞内Mps低产胞外Mps的红曲菌株提供理论基础。相关研究目前未见报道。研究表明,丝状真菌次生代谢产物的胞内运输和(胞外)分泌主要依赖主动运输(Active transport)和囊泡运输(Vesicle transport)两种方式。主动运输是一种逆浓度梯度跨膜运输方式,除耗能外,还需要载体蛋白(Carrier protein)的参与。目前已知的载体蛋白包括ABC转运蛋白超家族(ATP-binding cassette,ABC)和主要协助转运蛋白超家族(Major facilitator superfamily,MFS)等。而囊泡运输是通过囊泡将需要运输的物质从胞内供体囊泡膜定向运输到受体囊泡和/或细胞膜的过程。它包括囊泡萌发、转运、锚定和融合四个步骤,需要Rab蛋白(Ras-associated binding GTPases)、锚定蛋白(Ankyrin,Ank)和栓系因子(Tetheringfactors)等蛋白的参与。这些蛋白的相关基因常位于次生代谢产物合成基因簇中,也可能位于基因簇外。在以往的研究中还发现,囊泡运输作为真核生物特有的一种物质运输方式,在运输过程中囊泡(Vesicle,Ve,直径<2.5μm)与液泡(Vacuole,Va,直径≥2.5 μm)数量与两者的比例(Ve/Va值)的变化与真菌次生代谢产物的合成及运输密切相关:Ve一般携带有较多的物质合成早期与中期所需的酶及中间产物,通常Ve数量及Ve/Va值都升高时,有利于胞内相关物质的转运,从而使胞内产物含量上升。本实验室前期在红色红曲菌(M.ruer)M7的Mps合成基因簇中发现了参与主动运输的载体蛋白MFS和参与囊泡运输的蛋白Ank的基因MpigP和MpigL,并在M7的基因组中发现了参与囊泡运输的Rab蛋白的基因Ypt7。本研究将以M M7为出发菌株,通过基因敲除(包括单、双敲)、回补和过表达技术分别构建MpigP、MpigL和Ypt7基因的突变株,分析各突变株胞内外Mps含量变化,菌丝中Ve与Va数量与比例的变化,转录组分析Ypt7基因缺失突变株中ABC/MFS蛋白、Ank蛋白、囊泡转运相关蛋白等与转运和分泌相关蛋白基因转录水平的变化,以期了解Mps的胞内运输和胞外分泌过程,以提高胞内Mps产量。研究成果如下:1 MpigP基因敲除、回补和过表达菌株的构建及特征分析根据同源重组原理,以Mruber M7为出发菌株,构建了MpigP基因敲除突变株ΔMpigP和组成型trpC启动子控制的过表达菌株M7::PtrpC-MpigP;并以ΔMpigP为出发菌株,构建了回补突变株ΔMpigP::MpigP。分析了各菌株的菌落与显微形态、产孢能力、菌丝内Ve与Va数量与比例及胞内外Mps的含量。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potatodextrose agar medium,PDA)、麦芽汁琼脂培养基(Malt extract agar,MA)、察氏酵母提取粉琼脂培养基(Czapek yeast exatract agar,CYA)和25%甘油硝酸盐琼脂培养基(25%Glycerol nitrate agar,G25N)等4种红曲菌研究常用的培养基上28℃培养15 d后,与M7相比,ΔMpigP、ΔMpigP::MpigP和M7::PtrpC-MpigP菌落与显微形态、产孢能力及Va、Ve数量与比例均没有区别。在 PDA 培养基上 28℃ 培养 11d,ΔMpigP、ΔMipigP::MpgP和M7::PtrpC-MpigP胞外的黄、橙、红色素含量与M7均无差异。但在胞内色素方面,ΔMpigP黄色素含量在整个培养过程始终是M7的3倍左右,而橙、红色素含量,在培养前期(第3 d)只有M7的30%左右,后期(5-11 d)与M7相当;ΔMpigP::MpigP黄、橙、红色素含量在整个培养过程中与M7相似;M7::PtrpC-MpigP黄色素含量在整个培养过程与M7相当,而橙、红色素含量,在前期(第3 d)是M7的2倍左右,后期(5-11 d)与M7相当。以上结果表明,MpigP可能主要参与了黄色素胞内转运,并影响橙、红色素的合成。2 MpigL基因敲除、回补和过表达菌株的构建及特征分析根据同源重组原理,以M.ruber M7为出发菌株,构建了MpigL基因敲除突变株ΔMpigL、组成型trpC启动子控制的过表达菌株M7::PtrpC-MpigL;并以AMpigL为出发菌株,构建了回补菌株ΔMpigL::PtrpC-MpigL。分析了各菌株的菌落与显微形态、产孢能力、菌丝内囊泡与液泡数量与比例及胞内外Mps含量。在PDA、MA、CYA、G25N等4种培养基上28℃培养15 d后,与M7相比,AMpigL菌落与显微形态、产胞能力、菌丝内Ve与Va数量与比例均无差异;ΔMpigL::PtrpC-MpigL和M7::PtrpC-MpigL的菌落大小、菌丝形态及产孢能力无差别,而菌落颜色明显变浅,菌丝内Ve数量基本无差异,Va数量(个/100 μm菌丝)降低了约50%,Ve与Va的比例提高了约1倍。在PDA上28℃培养11 d,分析了各菌株胞内外色素含量的差异。胞内色素与M7相比,ΔMpigL在培养前期(3-7d)黄色素只有M7的70%左右,后期(9-11 d)与M7相当;而橙、红色素含量始终与M7相当。ΔMpigL::PtrpC-MpigL和M7::PtrpC-MpigL在培养前期(第3d)黄色素含量降低了约50%,后期(5-11 d)与M7相当;橙、红色素前期(第3 d)分别降低了 90%和50%,后期(5-11 d)橙色素降低了约50%,红色素与M7相当。胞外色素与M7相比,在整个培养过程中,ΔMpigL黄色素无差异,橙色素降低了约50%,红色素第3 d降低了约50%,培养至5-7d升高了约1倍,9-11 d无差异。ΔMpigL::PtrpC-MpigL和M7::PtrpC-MpigL在整个培养过程中,黄色素无差异;橙、红色素含量分别降低了约50%和60%。这些结果表明,MpigL可能提供了携带有黄色素的Ve膜与细胞器(橙色素合成场所)膜的结合位点,通过囊泡运输影响橙、红色素的胞内含量和向胞外分泌,且过表达后过量的结合位点负调控胞内黄色素的运输。3 Ypt7基因敲除和过表达菌株的构建及特征分析根据同源重组原理,以M ruber M7为出发菌株,构建了Ypt7基因敲除突变株ΔYpt7和组成型trpC启动子控制的过表达菌株M7::PtrpC-Ypt7。分析了各菌株的菌落与显微形态、产孢能力、菌丝内Ve与Va数量与比例及胞内外Mps含量。在PDA、MA、CYA、G25N等4种培养基上28℃培养15 d后,与M7相比,ΔYpt7菌落明显小于M7,菌落颜色变深,分生孢子和闭囊壳的数量明显减少,菌丝中Ve数量(个/100 μm菌丝)比M7增加了约20倍,Va数量减少,且分布不均匀;M7::PtrpC-Ypt7菌落颜色与形态、产孢能力及菌丝内Ve与Va数量和比例无区别。在PDA上28℃培养11 d,分析了各菌株胞内外色素含量的差异。对于胞内色素,AYpt7的黄、橙、红色素均有提高,分别约为M7的1.8倍、1.3倍和2.8倍;M7::PtrpC-Ypt7的黄、橙、红色素分别约为M7的1.2倍、1.3倍和1.1倍。对于胞外色素,AYpt7黄、橙、红色素均有些许降低,分别约为M7的63%、45%和83%。M7::PtrpC-Ypt7黄、橙、红色素分别约为M7的1.4倍、1.1倍和1.2倍。这些结果表明,Ypt7可能调控着Mps的胞外分泌。4 MpigP、MpigL和Ypt7基因两两双敲菌株的构建及特征分析根据同源重组原理,采用潮霉素和新霉素双筛选标记,构建了 和Ypt7基因两两双敲菌株ΔMpigPAYpt7、ΔMpigLΔYpt7和ΔMpigPΔMpigL。分析了各菌株的菌落与显微形态、产孢能力、菌丝内Ve与Va数量与比例及胞内外Mps含量。在PDA、MA、CYA、G25N等4种培养基上28℃培养15 d后,AMpigPAYpt7和AMpigLAYpt7菌落颜色与形态、显微形态、产孢能力、菌丝内Ve与Va数量均与ΔYpt7相似:与M7相比菌落变小、菌落颜色变深,闭囊壳和分生孢子的数量变少,菌丝内Ve数量增加,Va数量变少。与M7相比,ΔMpigPΔMpigL菌落略大,菌落正、反面颜色变浅,闭囊壳和分生孢子的数量、Ve与Va数量均明显减少。在PDA上28℃培养11d后,分析了各菌株胞内外色素含量的差异。对于胞内色素,在整个培养过程中,ΔMpigPΔYpt7黄、红色素含量比这两个基因的单敲菌株均提高,分别约为M7的3.5和2倍,橙色素含量则降低,约为M7的35%;ΔMpigLΔYpt7黄、红色素含量比单敲均提高,约为M7的2倍,而橙色素含量与M7相当。而AMpigPAMpigL黄、红、橙色素与这两个基因的单敲相比均进一步降低,分别仅约为M7的12%、3%和未检出。而胞外色素,在整个培养过程中,AMpigPΔYpt7黄、橙、红色素含量均低于这两个基因的单敲菌株,分别约为M7的62%、12%和50%;AMpigLΔYpt7黄色素与这两个基因的单敲菌株相当,橙、红色素含量则降低,分别约为M7的61%、17%和50%;ΔMpigPAMpigL黄、橙、红色素含量均低于这两个基因的单敲菌株,黄色素约为M7的12%,橙、红色素未检出。以上结果,结合三个基因的单敲结果说明,MpigP主要参与胞内Mps,特别是黄色素的转运,进而影响橙色素的合成;MpigL主要影响Mps的胞内转运和胞外分泌,并进一步影响Mps的合成;而Ypt7可能是介导Mps的胞内运输和向胞外分泌的主要途径。5基于RNA-seq的结果分析转运蛋白相关基因对Mps的转运与分泌作用以上3和4的研究结果表明,Ypt7显著影响Mps的胞内运输和胞外分泌,因此采用RNA-seq技术分析了 ΔYpt7在PDB培养中,28℃,120 r/min,培养至3 d和7 d时,M7和AYpt7的差异表达的基因及其功能,以期揭示转运相关基因对Mps转运与分泌作用。培养至第3d时,与M7相比,AYpt7中376个基因上调,456个基因下调;培养至第7d时ΔYpt7中的598个基因上调,425个基因下调。培养至第3d时,在ΔYpt7基因组中,263个ABC/MFS转运相关蛋白中的8个,18个Ank中的2个,70个囊泡转运蛋白中的2个的对应基因表达下调,而6个ABC/MFS转运蛋白,1个Ank蛋白,6个囊泡运输相关蛋白基因表达上调,此外,ΔYpt7中还有52个核糖体蛋白(Ribosomal protein)基因的表达上调;培养7 d时,6个ABC/MFS转运蛋白,2个囊泡转运相关蛋白和LaeA全局调控因子对应基因表达下调,13个ABC/MFS转运蛋白,1个Ank蛋白,9个囊泡转运蛋白相应基因表达上调,另外15个生物合成酶及调节因子和3个核糖体蛋白相应基因表达上调。以上结果表明,Ypt7通过影响跨膜转运和囊泡转运相关蛋白基因和次生代谢产物合成相关基因的表达,共同介导Mps的胞内运输和向胞外分泌,以及Mps的合成。6 Mps的胞内转运和胞外分泌的可能途径根据上述结果,推导了 Mps的胞内转运和胞外分泌途径。基本过程为:合成Mps的相关酶和相关中间产物经高尔基体分泌到细胞质中早期内涵体(Early endsome,EE)中,然后将酶与中间产物分别转运到黄色素内涵体(Yellow pigment endsome,YPE)、橙色素(Orange pigment endsome,OPE)、红色素(Red pigment endsome,RPE)等内涵体。其中,合成黄色素的相关酶和中间产物进入YPE中,合成黄色素。其合成的黄色素一是在Ypt7蛋白的作用下,通过囊泡运输方式直接分泌至胞外;二是在Vps1(Vesicle protein sorting protein 1)和MpigP共同作用下,或者Vps2的作用下,通过与Ank(MpigL基因编码)上不同的结合位点结合将黄色素和相关酶转运到OPE中合成橙色素。合成的橙色素一是在Ypt7的作用下,通过囊泡分泌到胞外;二是在Vps3及囊泡膜上的SNARE 蛋白(Vesicle membrane-SNARE)的作用下,识别 RPE 膜上的 SNARE 蛋白(Target membrane-SNARE),形成SNARE复合体将橙色素及相关酶转运到RPE中合成红色素。合成的红色素一部分在Ypt7的作用下,通过囊泡分泌到胞外,另外一部分则留在胞质中。