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Notch基因在无脊椎动物和脊椎动物中都广泛存在且高度表达,并且在不同物种间都具有高度的进化保守性。Notch信号通路的功能复杂多样,调控正常细胞的生长分化,决定细胞的命运,参与调控细胞生命活动的方方面面,在哺乳类动物中,Notch参与造血、T细胞发育、血管生成等重要生理过程,并与肿瘤形成和某些神经系统疾病有密切关系。本实验室采用Tet-on基因表达系统,建立了可动态调控NICD基因表达的PC12-Notch1细胞系,克服了传统研究方法不能准确调控细胞内Notchl表达的缺点,有利于更好的研究Notchl对PC12细胞的作用以及其中的分子机制。自噬在肿瘤的发生发展中有着重要作用,且已有研究表明Notch与自噬的信号调控有关。本实验旨在PC12-Notchl细胞系的基础上研究PC12细胞内Notchl基因对细胞内自噬和细胞生物学特的影响及PI3K-AKT-MTOR通路hIRNA的变化,探讨可能的调控机制。目的四环素衍生物强力霉素(DOX)动态调控Tet-on基因表达系统PC12-Notchl细胞中Notch1胞内段(NICD)的表达,检测在Notchl不同的表达水平上PC12细胞增殖、凋亡和细胞内自噬水平的变化。研究Notchl基因对细胞内自噬和细胞生物学特的影响及PI3K-AKT-MTOR通路mRNA的变化,探讨其可能的调控机制。方法1.检测PC12-Notchl细胞内NICD的表达：复苏PC12-Notchl细胞,取两代之后的细胞接种六孔板,加入四环素DOX(1ug/m1)诱导细胞内NICD的表达。根据DOX诱导时间分为六各不同时间组(分别是Oh,12h,24h,36h,48h,60h).荧光倒置显微镜下观察不同诱导时间组内细胞生长形态和细胞内绿色荧光蛋白EGFP的表达,每孔计数三个视野内的EGFP阳性表达率,最后计算平均值,得出各诱导时间组EGFP阳性细胞百分比。消化各组细胞,上流式细胞仪测量各组细胞内NICD的荧光表达强度,绘制DOX不同诱导时间点PC12-notch1细胞内NICD表达趋势图。2.检测高表达NICD的PC12-Notch1细胞周期和凋亡：将PC12-Notchl细胞接种六孔板,加入四环素DOX (lug/ml)诱导NICD的表达,仍旧根据DOX诱导时间分为六各不同时间组(分别是Oh,12h,24h,36h,48h,60h).消化各时间组的细胞,上流式仪测量各时间组NICD不同的表达水平上细胞内周期及凋亡率的变化。3. PC12-Notch1细胞自噬的检测：消化各时间组的细胞并提取蛋白质,Westernblot检测自噬标志蛋白LC3B,Beclinl,ATG7,ATG5的表达。软件分析曝光条带灰度值并比较各时间组细胞内自噬蛋白的表达差异。4.荧光定量PCR检测PC12-Notchl细胞内自噬信号通路：提取各时间组细胞内RNA,将RNA反转录成cDNA,荧光定量PCR检测PI3K、AKT、mTOR等基因的表达,比较在不同分组间mRNA表达差异。结果1.荧光表达量：加入6OX诱导后,在显微镜下观察PC12-Notchl内绿色荧光蛋白的表达量和流式细胞仪检测荧光强度,发现0h组细胞未观察到绿色荧光,随着诱导时间的增加,从12h组,24h组再到36h组细胞中绿色荧光蛋白表达量逐渐增加,细胞荧光表达率分别为20%,55%,71%。在诱导36h时荧光表达强度和荧光表达率达到最高,之后再持续给药诱导48h,60h时发现NICD荧光表达率和表达强度有所下降,但都高于0h组,荧光表达率分别为63%,59%。各诱导时间组细胞内NICD的荧光强度都显著高于非诱导组。2.细胞周期和凋亡：在PC12-Notch1DOX非诱导细胞组中,细胞的凋亡率维持较低水平。随着诱导时间的增加直到最大诱导时间60h组,PC12-Notch1细胞凋亡率是逐渐升高的,60h时凋亡率达到最高,统计分析各诱导组与非诱导组相比都具有显著向差异。在PC12-Notch1DOX非诱导组细胞中,细胞的S期较高。从0h组开始随着诱导时间的增加直到最大诱导时间60h组,PC12-Notch1细胞周期中S期逐渐降低,60h组S期达到最低。3.细胞自噬水平的变化：Westernblot检测各时间组细胞内自噬标志蛋LC3B,Beclin1,ATG7,ATG5的表达。应用软件Image对曝光条带灰度值分析得出这四种自噬蛋白的表达量先随DOX诱导时间增加而升高到36h达到最高,说明此时细胞自噬水平达到高峰,之后再持续诱导48h,60h时发现灰度值呈现逐渐下降趋势,但都高于Oh组；方差分析得,各诱导时间组细胞内LC3B,Beclin1,ATG7,ATG5的表达量都显著高于非诱导组。4.荧光定量PCR检测DOX不同诱导时间组PC12细胞内基因PI3K、AKT、 mTOR、GADPH的表达。分析结果可得：各个实验组细胞内PI3K、AKT、 mTOR的表达比非诱导组明显降低,且具有显著差异(P<0.01)。结论1.利用强力霉素(DOX)动态调控Tet-on基因表达系统PC12-Notch1胞中Notch1胞内段NICD的表达,其效能与诱导时间密切相关。2.随着PC12细胞内NICD表达量增高,PC12细胞的细胞周期受到抑制增强,细胞凋亡率逐渐升高。3.PC12细胞内NICD表达量增高,细胞内自噬激活,其机制与PI3K-AKT-MTOR通路抑制有关。