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研究背景炎性水平和免疫功能与肿瘤的发生发展密切相关,而作为促进肿瘤进展的重要危险因素,炎性因子能通过多种机制抑制荷瘤机体的抗肿瘤免疫应答,其中一种方式是诱导髓系免疫抑制细胞（myeloid-derived suppressive cells,MDSC）的大量扩张和激活,不同程度地破坏CD8+T细胞和自然杀伤（naturalkiller,NK）细胞的增殖、迁移和活化。减轻荷瘤机体的炎性水平以解除免疫抑制状态进而增强抗肿瘤免疫功能已成为肿瘤治疗的重要策略。针灸对多种免疫效应分子和细胞具有良好的调控作用,能有效增强机体的免疫功能。此外,针灸干预能减轻过度的炎性反应,在多项炎性疾病的临床研究中均显示出良好疗效。有关针灸抗炎效应机制的研究表明,激活迷走传出神经抑制过度产生的炎性因子是电针足三里发挥抗炎作用的重要途径。研究目的及意义探索电针足三里能否通过迷走传出神经抑制荷瘤小鼠的炎性水平,减轻免疫抑制状态,增强抗肿瘤免疫功能,减缓肿瘤的进展,为扩大针灸在肿瘤的临床应用提供一定的科学依据。研究方法第一部分:将雌性BALB/c小鼠随机分为正常对照组、模型组和电针组,在模型和电针组小鼠右侧第二乳垫下注射4T1-luc2小鼠乳腺癌细胞制备原位乳腺癌模型,对电针组小鼠的双侧足三里行电针干预（0.1 mA,2/15 Hz,30 min）,隔日一次。使用游标卡尺测量并计算肿瘤体积;采用活体成像技术在体检测瘤体的位置、面积和荧光强度;电针干预结束后取出瘤体和脾脏称重比较,以整体观察小鼠的肿瘤生长情况。第二部分:采用MSD多因子和Western Blot技术检测实验小鼠血清和肿瘤局部组织内炎性细胞因子肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）-α、白细胞介素（interleukin,IL）-1β和IL-10的含量,同时采用HE染色观察荷瘤小鼠肿瘤局部组织内的炎性浸润情况,以观察电针对乳腺癌模型小鼠的抗炎作用。第三部分:采用流式细胞术分析实验小鼠外周血、脾脏和肿瘤局部组织内的抗肿瘤免疫细胞CD8+T细胞和NK细胞的比例,同时采用Western Blot技术分析肿瘤局部组织内穿孔素和颗粒酶B的蛋白表达水平,以评价荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫功能。第四部分:采用流式细胞术分析实验小鼠外周血、脾脏和肿瘤局部组织内免疫抑制细胞MDSC的比例,采用Western Blot技术分析肿瘤局部组织内环氧合酶-2（Cyclooxygenase 2,COX-2）和精氨酸酶-1（Arginase-1,Arg-1）的蛋白表达水平;此外,分离正常小鼠的脾T细胞与模型组和电针组荷瘤小鼠的脾MDSC进行体外共培养,采用CellTrace Far Red检测T细胞的增殖水平,流式细胞术分析CD25分子的表达量以显示T细胞的活化水平,以分析荷瘤小鼠体内的免疫抑制状态。第五部分:共包括三个部分。实验一验证了电针足三里对荷瘤小鼠迷走传出神经的作用:首先采用荧光免疫组织化学技术对荷瘤小鼠脑干迷走神经背核（dorsal motor nucleus of vagus,DMV）内胆碱乙酰转移酶（Choline acetyltransferase,ChAT）阳性神经元的c-Fos进行标记,观察迷走传出神经元的激活水平;其次,采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠血浆和肿瘤局部组织内乙酰胆碱（acetylcholine,ACh）的水平,以反映迷走传出神经被激活后的效应。实验二观察了激活α7nAchR对乳腺癌模型小鼠免疫功能与炎性反应的作用:将正常和乳腺癌模型小鼠随机分为正常对照组,二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）组和 PNU-282987 组,对 DMSO 组小鼠腹腔注射DMSO,PNU-282987组小鼠腹腔注射选择性α7亚型烟碱受体（α7 subunit ofthe nicotinic acetylcholine receptors,α7nAchR）激动剂 PNU-282987（0.1 mg/kg）,隔日注射一次,游标卡尺测量并计算肿瘤体积,并进行活体成像检测,干预结束后取出脾脏和瘤体称重;MSD多因子技术检测外周血和肿瘤局部组织内炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-10的含量;流式细胞术分析外周血和脾脏内的CD8+T细胞、NK细胞和MDSC的比例。实验三采用了膈下迷走神经切断术进行了反向验证:对小鼠行膈下迷走神经切断术或假手术后接种4T1-luc2细胞制备原位乳腺癌模型,再随机分为手术-模型组（VNX）、手术-电针组（VNX-EA）、假手术-模型组（sVNX）和假手术-电针组（sVNX-EA）,对VNX-EA和sVNX-EA组小鼠双侧足三里行电针干预,干预结束后对小鼠进行活体成像检测并取出瘤体和脾脏称重,采用流式细胞术分析各组小鼠外周血和脾脏内的CD8+T细胞、NK细胞和MDSC的比例。研究结果第一部分:电针足三里可有效减缓乳腺癌模型小鼠肿瘤的进展。接种4T1-luc2细胞的第18天,电针组小鼠的肿瘤体积开始低于模型组（P<0.05）,且持续到接种后第22天（P<0.05）;活体成像结果显示,与模型组小鼠相比,电针组小鼠瘤体的成像面积减小,荧光强度降低（P<0.05）,重量明显减轻（P<0.01）。此外,荷瘤小鼠出现明显脾肿大,而电针组小鼠脾肿大程度较模型组减轻（P<0.01）。第二部分:电针足三里减轻了乳腺癌模型小鼠系统性和肿瘤局部炎性水平。荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10的含量均显著上升（P<0.001）,电针干预后,小鼠血清（P<0.01）和肿瘤局部组织（P<0.05）中促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的水平降低,抗炎性细胞因子IL-10无明显变化（P>0.05）。HE染色结果显示,电针组小鼠肿瘤局部的炎性浸润情况较模型组减轻。第三部分:电针足三里对乳腺癌模型小鼠的抗肿瘤免疫细胞具有明显的促进作用。荷瘤小鼠外周血和脾脏内CD8+T细胞和NK细胞的比例均显著降低（P<0.001）,电针干预后,外周血、脾脏和肿瘤局部组织内CD8+T细胞（外周血,P<0.01;脾脏,P<0.05;肿瘤局部组织,P>0.05）和NK细胞（P<0.05）的比例均升高。此外,电针组小鼠肿瘤局部组织内穿孔素（P<0.05）和颗粒酶B（P<0.01）的蛋白表达水平较模型组明显增高。第四部分:电针足三里能有效抑制乳腺癌模型小鼠的MDSC。荷瘤小鼠外周血、脾脏和肿瘤局部组织内出现大量MDSC（P<0.001）,电针干预后,小鼠外周血（P<0.05）、脾脏（P<0.001）和肿瘤局部组织内（P<0.05）MDSC的比例均明显降低,MDSC的扩张程度减轻。此外,电针组小鼠肿瘤局部组织中COX-2（P<0.05）和Arg-1（P<0.05）的蛋白表达水平明显低于模型组。体外共培养结果显示,相比较与模型组小鼠MDSC共培养的T细胞,与电针组小鼠MDSC共培养的T细胞增殖和活化的程度升高（P<0.05）。第五部分:迷走传出神经参与了电针足三里对乳腺癌模型小鼠炎性水平与免疫功能的调控作用。实验一中,荷瘤小鼠脑干DMV区ChAT+神经元的c-Fos表达量在电针干预后显著增多,血浆和肿瘤局部组织内ACh的水平也明显升高。实验二中,从肿瘤生长情况来看,相比于DMSO组,PNU-282987组小鼠肿瘤生长速度减慢（P<0.05）,瘤体的成像面积和荧光强度降低（P<0.05）;多因子检测结果显示,相比于DMSO组,PNU-282987组小鼠血清TNF-α和IL-1β的含量明显降低（P<0.05）,IL-10无明显变化（P>0.05）;在肿瘤局部组织内,PNU-282987 组小鼠 TNF-α 和 IL-1β 的含量无明显变化（P>0.05）,IL-10 的含量明显升高（P<0.05）;流式细胞术结果显示,相比于DMSO组,PNU-282987组小鼠脾脏内的CD8+T细胞比例回升（P<0.05）,NK细胞比例无明显变化（P>0.05）,同时,外周血和脾脏内MDSC的比例降低（P<0.05）。实验三中,对实验小鼠行膈下迷走神经切断术或假手术后,相比于sVNX组,sVNX-EA组小鼠的瘤体成像面积缩小,荧光强度降低（P<0.05）,瘤体（P<0.05）和脾脏（P<0.01）的尺寸减小,重量减轻;外周血和脾脏内CD8+T细胞和NK细胞的比例升高,MDSC的比例下降。而相比于VNX组,VNX-EA组小鼠瘤体的成像面积、荧光强度、瘤体和脾脏的尺寸及重量、外周血和脾脏内的CD8+T细胞、NK细胞以及MDSC的比例均无明显改变。研究结论电针足三里可能通过激活迷走传出神经,减轻荷瘤小鼠系统性和肿瘤局部的炎性水平,促进CD8+T细胞和NK细胞的比例和细胞杀伤功能,同时降低MDSC的比例和免疫抑制水平,增强荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫功能,减缓肿瘤的生长。