miR-187-3p通过靶向调控PTRF抑制先天性肾积水肾功能损伤的机制研究

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fishe1042
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
研究背景与目的:肾盂输尿管连接部梗阻(ureteropelvic junction obstruction,UPJO)引起的先天性肾积水是小儿常见的泌尿系统畸形。它是胎儿、婴儿和儿童先天性尿路梗阻的主要原因。先天性梗阻性肾病是儿童和婴儿慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)和终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)最常见的病因之一,表现为进行性不可逆的结构损害和/或肾功能损害,越来越被认为是一个重要的公共卫生健康问题。尿路梗阻后引起肾功能损伤是一个多基因、多因子和多机制共同作用的复杂过程,涉及到氧化应激、细胞凋亡、炎症反应、上皮间质转化及纤维化的多种病理进程。在过去的十年中,许多研究致力于探索CKD进展的分子机制,已经证明多种经典信号通路在该疾病进展过程中发挥着不可替代的作用,然而,基因相关的上游分子表达及调控与肾纤维化和功能损害的发生机制尚不清楚。MicroRNAs(miRNAs或miRs)是一类内源性的、小的、非编码的RNA,在转录后水平对基因表达起着重要的调控作用。以往的临床和实验动物研究表明,miRNAs在各种肾脏疾病的发病机制中发挥着重要作用,miRNAs可能作为生物学标志物或用于干预疾病进展来诊断或治疗疾病。但这些研究要么基于动物模型,要么仅限于某一个感兴趣的miRNA。通过高通量测序技术获得正常分肾功能和分肾功能下降的先天性肾积水患儿肾脏组织中差异表达的miRNAs,验证并且筛选出在先天性肾积水患儿肾功能损伤过程中起到关键作用的miRNAs,针对这方面的设想,我们展开了第一部分的实验。通过转染人肾小管上皮细胞系(human kidney epithelial cell line,HK-2)观察差异miRNAs对细胞上皮间质转化功能的影响。通过数据库预测软件挑选有可能与差异miRNAs靶向结合的m RNA,通过细胞转染实验扩增和抑制差异miRNAs筛选出反向变化的m RNA,通过文献检索,筛选出既往双荧光素酶报告基因检测证实二者之间存在调控关系的m RNA,并得到差异miRNAs可以通过靶向结合的m RNA调控HK-2细胞上皮间质转化功能,针对这部分设想,我们展开了第二部分实验。制作新生大鼠单侧输尿管完全梗阻模型模拟人类先天性肾积水,收集肾脏组织,验证差异miRNAs和靶向结合的m RNA在输尿梗阻组及正常组中差异表达。通过鼠尾静脉注射方法将差异miRNAs agomir转染肾积水动物模型,在体内实验中验证二者之间的调控关系,并得到差异miRNAs可以通过靶向结合的m RNA调控新生大鼠单侧输尿管完全梗阻后肾组织的上皮间质转化功能。针对这部分设想,我们展开了第三部分实验,为更好地探讨差异miRNAs在先天性肾积水肾功能损伤中发挥作用提供科学依据,为将来实现miRNAs作为先天性肾积水患儿肾功能损伤的诊断生物学标志物或分子治疗奠定重要基础。研究方法:1、我们选取了肾盂输尿管交界处梗阻所致的先天性肾积水患儿,按照术前利尿性肾核素显像显示的分肾功能,将其分为肾功能正常组(分肾功能大于45%),肾功能损伤组(分肾功能小于30%组),手术时取材,获取肾实质最薄处肾组织,立即在液氮中冷冻,并于-80°C冰箱低温保存,用于高通量测序、qRT-PCR检测。2、通过高通量测序技术筛选肾功能损伤组及正常组肾脏组织中差异表达的miRNAs,预测其亲本基因富集的主要功能和信号通路,应用qRT-PCR对差异表达的miRNAs在患儿肾脏组织、新生大鼠输尿管单侧梗阻模型及HK-2细胞模型进行验证,获得差异miRNAs在动物模型及细胞模型中的时空表达情况。3、通过数据库预测与差异miRNA结合的m RNA,利用HK-2细胞转染实验扩增和抑制miRNA187-3p筛选出反向变化的m RNA,通过文献检索,筛选出既往双荧光素酶报告基因检测证实miR-187-3p与PTRF和NT5E之间存在直接靶向调控关系,验证miR-187-3p通过靶向结合PTRF调控HK-2细胞上皮间质转化、纤维化及TGFβ/Smad2通路的功能。4、制作新生鼠单侧输尿管梗阻模型,应用免疫组织化学方法对PTRF和NT5E在梗阻后肾组织的表达进行定位,在输尿管梗阻及正常新生大鼠的肾脏组织中验证miR-187-3p、PTRF和NT5E的表达差异。检测上调或下调miRNA187-3p对输尿管梗阻后肾脏上皮间质转化、纤维化及TGFβ/Smad2通路的影响。5、统计分析:Western blot如条带差异不明显,则使用Image-J软件检测条带相对密度。Real-time PCR数据用2-△△Ct值表示,应用SPSS21.0统计软件进行统计学分析,应用Graph Pad Prism 8绘制图表。对数据进行t检验,所有的实验数据均以均值±标准差来表示,p<0.05认为有统计学差异。结果:1、所有先天性肾积水患儿均为胎SFU4度肾积水。用于高通量测序的6例患儿中,肾功能正常组年龄分布在6-14周(中位年龄10周),肾功能异常组年龄分布在7-18周(中位年龄10周)。用于结果验证的另6例患儿中,肾功能正常组年龄分布为12~20周(中位年龄13周),肾功能异常组年龄分布为6~22周(中位年龄12周)。高通量测序结果提示,肾功能下降及肾功能正常的先天性肾积水患儿肾脏组织中共得到22个差异表达的miRNA,与肾功能正常组相比,肾功能下降组中5个miRNA表达上调,17个miRNA表达下调。选择12个人鼠同源的miRNA在患儿肾组织、动物模型肾组织、细胞模型中进行RT-q PCR验证,发现miR-21-5p和miR-187-3p在组间表达存在差异,与测序结果基本一致,但差异倍数有所不同。其中miR-187-3p在梗阻性肾疾病的miRNA-靶基因-信号通路网络尚未有研究,因此我们选择miR-187-3p作为进一步研究对象。2、在单侧输尿管梗阻动物模型和HK-2细胞模型中利用qRT-PCR技术验证miR-187-3p的时空表达趋势,与正常组相比,输尿管梗阻组和TGFβ诱导组的miR-187-3p表达在梗阻后早期升高,随着梗阻时间延长表达逐渐降低,于输尿管梗阻第5天和TGFβ诱导第6天降至正常组水平以下。与我们前期研究发现新生鼠输尿管梗阻5天后出现肾小管上皮间质转化相吻合。3、通过数据库预测与miR-187-3p结合的m RNA共23个,在HK-2细胞内验证得到miR-187-3p负向调控PTRF和NT5E的表达,过表达miR-187-3p后,PTRF和NT5E的表达均降低;抑制miR-187-3p表达后,PTRF和NT5E的表达均所增加。检索已发表的文献中双荧光素酶报告基因检测结果提示:miR-187-3p与PTRF和NT5E均存在结合位点,后二者是miR-187-3p的直接下游靶基因。我们构建了miR-187-3p的模拟物,将miR-187-3p的模拟物转染至细胞模型中,抑制了TGFβ诱导的上皮间质转化及纤维化作用,同时抑制了TGFβ/Smad2通路Smad2磷酸化的作用。由此我们得到,miR-187-3p通过负向调控PTRF和NT5E的表达,对HK-2细胞上皮间质转化功能和TGFβ/Smad2通路进行调控。4、我们构建了miR-187-3p的模拟物,将miR-187-3p的模拟物转染至动物模型体内,实验验证提示:miR-187-3p可以负向调控PTRF和NT5E的表达,抑制单侧输尿管梗阻模型中肾脏组织上皮间质转化、纤维化,同时抑制TGF/Smad2通路Smad2的磷酸化。因此,我们认为miR-187-3p靶向调控PTRF在先天性肾积水肾功能损伤中起到调节作用。结论:1、上述结果表明先天性肾积水患儿正常肾功能和肾功能下降的肾脏组织中miRNAs具有差异表达的特性。2、miR-187-3p与先天性肾积水肾功能损伤相关,miR-187-3p在梗阻性肾损伤早期肾脏组织中升高,晚期降低。miR-187-3p通过负向调控PTRF和NT5E抑制了先天性肾积水肾功能的进一步损伤。3、在肾脏组织中miR-187-3p表达增高会抑制肾组织上皮间质转化和纤维化的进展,同时抑制TGFβ/Smad2通路Smad2磷酸化的作用;在HK-2细胞中表达增高会抑制肾脏细胞上皮间质转化和纤维化,同时调控TGFβ/Smad2通路Smad2的磷酸化。
其他文献
目的:妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠期最常见的并发症之一,不仅显著增加巨大儿、难产、手术产的发生率,还增加了母体和新生儿远期患2型糖尿病的风险,对母儿危害极大。骨形态发生蛋白-4(bone morphogenic protein-4,BMP-4)是转化生长因子-β超家族的成员之一,在胚胎发育、血管形成和软骨形成中发挥重要作用。近年来的体内外
目的研究食品安全抽检环节芹菜中10种有机磷农药的残留降解规律。方法以芹菜为基质,选择10种有机磷农药(乐果、毒死蜱、甲基对硫磷、杀螟硫磷、甲基异柳磷、喹硫磷、水胺硫磷、杀扑磷、三唑磷、伏杀硫磷)作为研究对象,采用加标后均质的制样方法制备样品,将农药残留检测结果通过拟合一级动力学模型预测农药的降解半衰期,研究抽检样品在不同储存条件(常温、冷藏和冷冻)下10种农药降解规律。结果在常温条件下半衰期平均为
背景:胰腺恶性肿瘤是消化系统恶性肿瘤中恶性程度最高的一种恶性肿瘤,诊断和治疗困难。源自导管腺上皮的导管腺癌占约90%,近年来其发病率和死亡率显着增加。5年生存率极低,是最严重的恶性肿瘤之一。胰腺癌的早期诊断率不高,手术死亡率高,治愈率很低。胰腺癌恶性程度高,手术切除率低,预后差。尽管手术仍然是主要治疗方法,但胰腺癌常因为发现较晚,错失了根治的机会,因此需要综合治疗胰腺癌。迄今为止,与大多数肿瘤一样
目的:妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)指的是在孕期任何孕周发现的不同程度的糖耐量异常,我国目前应用的诊断标准是国际糖尿病和妊娠研究组(International Association of Diabetes and Pregnancy Study Group IADPSG)以及美国糖尿病学会(Americn Diabetos Associatio
目的:双酚A(Bisphenol A,BPA)是一种高产量(high production volume,HPV)化学品,常用于食品包装材料、牙科密封剂、医疗器械和热载体。通过摄入、吸入和皮肤接触BPA是普遍存在的现象。美国的疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control,CDC)的报告指出,大约超过90%的美国人口的尿液样本可能含有一定含量的BPA。BPA被证明能够通
目的:随着社会的快速发展,生活方式及环境的改变对女性的生殖健康正发生着负面影响。全球每年新增约200万对不孕不育夫妇[1],不孕不育同肿瘤及心脑血管疾病并称为严重危害人类健康的三大疾病[2]。生殖能力下降现状已成为全社会面临的主要问题和严峻挑战。女性生殖能力下降主要体现在两个方面,不孕的发生和卵巢储备功能的减退。20世纪70-80年代,我国对不孕症患病率展开了流行病学调查,各地区不孕症患病率最高为
目的:卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,也是癌症死亡的第八大常见原因,大部分卵巢癌患者五年内生存率低于50%,已成为严重影响女性健康的疾病。研究发现因缺乏特异性的临床特征和症状,卵巢癌常在癌症晚期才被确诊,很多患者因此错过最佳的治疗时间。临床上大多数卵巢癌患者的治疗手段以手术治疗和全身性辅助化疗为主,但是以铂类为基础的化疗方案容易产生耐药性和发生术后复发,因此寻找卵巢癌发病中重要的致病基因及
目的:牙周病是由牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌等多种牙周致病菌单一或独立引发的牙周支持组织感染性疾病。随着炎症的进一步扩展,牙周膜、牙槽骨等牙周主要支持组织发生破坏,患牙通常可表现牙齿松动、牙龈红肿或出血,其咀嚼功能下降或完全丧失。鉴于上述病理特征,牙周炎已经成为造成当代成年人牙列缺损的主要原因。除影响咀嚼功能外,牙周炎亦可对患者的美观、发音甚至心理状态产生较大的影响。这也是当下口腔医师需要重点关
目的:冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting,CABG)是广泛应用于心脏外科的术式之一,临床上主要用于目前发病率一直居高不下的冠心病的外科治疗。在CABG手术过程中,心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)难以避免。MIRI发生之后可引起一系列炎症因子活化,后者可借由全身血液循环到达远处
目的:不孕症发病率逐年攀升,己成为继心血管疾病和肿瘤后严重影响人类健康的第三大疾病[1]。辅助生殖技术(Assisted reproductive technology,ART)的诞生在一定程度上解决了难治性不孕不育患者的生育问题。自1978年世界首例体外受精-胚胎移植婴儿诞生以来[2],辅助生殖技术飞速发展,其衍生技术不断更新,目前已有800万应用辅助生殖技术的新生儿诞生[3]。随着ART出生人