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内吞作用和外排作用是膜运输的重要过程,其中内吞作用是目前公认的生物体摄取生物大分子的主要途径,是确保细胞胞外和质膜上的小分子向胞质内运输的重要生理过程,对细胞的营养摄取,跨膜受体的活性调控及分泌囊泡的回收再利用都具有重要的功能意义。内吞作用主要有三种模式,包括网格蛋白介导型囊泡内吞(clathrin-mediated endocytosis)、触吻逃逸型内吞(kiss-and-run)和批量型内吞(bulk endocytosis),其中网格蛋白介导的囊泡内吞是目前研究最为深入的内吞途径。钙离子是囊泡外排的关键成分,研究发现网格蛋白介导的囊泡内吞也是钙离子依赖的,但钙离子在网格蛋白介导的内吞作用中的具体作用机制仍未明确。 肾上腺嗜铬细胞膜上网格蛋白介导的囊泡内吞的研究发现,突触结合蛋白Ⅰ(Syt1)在网格蛋白介导的囊泡内吞中具有重要的功能,其功能意义与网格蛋白介导的囊泡内吞所表现出的钙离子依赖性密切相关。作为膜固有蛋白成分,Syt1主要分布于细胞质膜和囊泡膜上,是囊泡外排作用的钙离子感受器,其C2A和C2B结构域可与钙离子结合,能够以钙离子依赖的方式与SNARE蛋白复合体、质膜磷脂酰肌醇及同源或异源的Syt结合,促进囊泡外排的膜融合过程。而Syt1在网格蛋白介导的囊泡内吞中重要功能的具体机制仍不清楚,Syt1的C2A和C2B结构域上钙离子的结合在网格蛋白介导的囊泡内吞中是否具有同样重要的功能意义因此成为非常值得探究的问题。本研究首次使用Syt1慢病毒(lentivirus)基因表达载体感染基因缺失型肾上腺嗜铬细胞的实验方法,采用细胞贴附式膜电容记录技术对网格蛋白介导的囊泡内吞中Syt1的功能机制进行研究。研究结果发现: 1 Syt1基因缺失,肾上腺嗜铬细胞膜上网格蛋白介导的囊泡内吞(CME)的囊泡数目下降,囊泡裂解时程增长。 2外源野生型Syt1慢病毒基因表达载体感染基因缺失型肾上腺嗜铬细胞,Syt1基因表达成功:经感染处理的基因缺失型细胞与未经感染处理的基因缺失型细胞相比,网格蛋白介导的囊泡内吞的囊泡数目增加,囊泡裂解时程缩短。 3 Syt1 C2AB结构域上Ca2+结合位点经突变不能结合Ca2+,产生Syt1 C2AB6DA突变体。Syt1 C2AB6DA慢病毒基因表达载体感染的基因缺失型细胞与野生型Syt1慢病毒基因表达载体感染的基因缺失型细胞相比,网格蛋白介导的囊泡内吞的囊泡数目下降,囊泡裂解时程增长。 综上所述,本研究结果表明C2AB结构域上的Ca2+结合位点是网格蛋白介导的囊泡内吞中Syt1的主要功能位点,该结论有助于对网格蛋白介导的囊泡内吞中Syt1的功能机制的深入研究。此外,Syt1慢病毒(lentivirus)基因表达载体感染基因缺失型肾上腺嗜铬细胞的实验方法,在本研究中首次得到应用,研究结果提示该实验方法高效适用于网格蛋白介导的囊泡内吞中Syt1的功能机制的研究。