食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一,我国食管癌的死亡率居世界首位,严重威胁着人民的身体健康,对食管癌的研究是我国肿瘤研究领域的重点之一。食管癌的发生发展是多阶段性、多基因参与及多种因子调控的过程,其中真核细胞起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E）的过表达在食管癌的发生发展中发挥着重要作用。eIF4E是一个分子量为24KD游离多肽,其基因定位于4q21-4q25,是一种新发现的原癌基因。在真核细胞中,eIF4E与eIF4A、eIF4G等共同组成帽子结合蛋白复合物（eIF4F）,从而对翻译起始发挥调节作用,是翻译起始过程中的重要限速酶。正常细胞中eIF4E低表达,主要促进管家基因的蛋白质翻译,维护细胞正常生长代谢需要。当eIF4E过表达时,可促进原癌基因的表达,产生大量的促癌因子,从而使细胞发生转化和恶变。真核细胞始动因子4E结合蛋白1（4E binding protein 1,4EBP1）是eIF4E的重要调节蛋白,人的4EBP1有118个氨基酸组成,其基因位于8p12。4EBP1通过自身不同的磷酸化状况来调控其与eIF4E的结合能力,从而间接影响蛋白质的翻译。低磷酸化的4EBP1与eIF4E具有较高的亲和力,可与eIF4G竞争性结合eIF4E,从而阻止翻译起始复合物eIF4F的形成。当4EBP1磷酸化时,将不能与eIF4E结合,eIF4E可与eIF4G、eIF4A形成翻译起始复合物,从而启动蛋白质的翻译过程。研究表明,eIF4E的过表达和4EBP1的磷酸化在肿瘤的发生发展中起重要作用,以eIF4E为靶点的抗肿瘤治疗的研究已引起人们的关注。Soni等人研究发现,在乳腺癌中抑制eIF4E的表达能有效抑制肿瘤的生长,同时检测发现4EBP1的表达降低。而在食管癌中有关影响eIF4E、4EBP1表达的研究尚未见有报道。反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASON）是指能与靶DNA或RNA以碱基配对的原则相结合的一小段核苷酸序列。ASON与靶mRNA上特定序列结合后能有效抑制或阻断mRNA的表达,因此,反义技术近年来已成为抗肿瘤领域研究的热点。榄香烯（Elemene）是从中药温莪术中提取的一种有效成分,化学名为1-甲基-1-乙烯基-2,4-二异丙基环已烷,具有抗肿瘤作用强、毒副作用小等特点。榄香烯已应用于临床并有显著的抗肿瘤作用,但其具体的抗肿瘤机制尚不清楚。本研究以人食管癌EC-1细胞为研究对象,探求eIF4E反义寡核苷酸和榄香烯对人食管癌细胞中eIF4E、4EBP1表达的影响,为食管癌的临床治疗提供理论依据。材料与方法1.人食管癌EC-1细胞由香港大学曹世华教授惠赠。2.食管癌EC-1细胞的培养:食管癌EC-1细胞以10%胎牛血清培养液（含青、链霉素各100^u/ml）在37℃、5%CO₂条件下贴壁培养。3.转染:应用LipofusinX脂质体将ASODNs转染食管癌EC-1细胞。4.应用免疫细胞化学SP法检测各实验组、对照组中eIF4E和4EBP1蛋白的表达情况。5.应用细胞原位杂交技术检测各实验组、对照组中eIF4E和4EBP1 mRNA的表达清况。6.统计学处理:采用SPSS 10.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差（（?）±S）表示,两组均数的比较用t检验,多组均数的比较用方差分析,方差不齐时先进行变量转换,α=0.05为显著性标准。结果1.榄香烯作用组免疫细胞化学结果:以20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml 3种不同浓度榄香烯作用食管癌EC-1细胞24h、48h、72h后,eIF4E、4EBP1蛋白表达均有所降低,以60μg/ml榄香烯作用72h后表达最低,各实验组与正常组相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）;在每个时间段内随着药物浓度的增加,eIF4E、4EBP1蛋白表达均降低,三种浓度两两相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）;在每个浓度内随着时间延长,eIF4E、4EBP1蛋白表达均有所降低,三个时间段两两相比,差异均无统计学意义（P＞0.05）。2.榄香烯作用组原位杂交结果:以20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml 3种不同浓度榄香烯作用食管癌EC-1细胞24h、48h、72h后,eIF4E、4EBP1 mRNA表达均有所降低,以60μg/ml榄香烯作用72h后表达最低,各实验组与正常组相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）;在每个时间段内随着药物浓度的增加,eIF4E、4EBP1mRNA表达均降低,三种浓度两两相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）;在每个浓度内随着时间延长,eIF4E、4EBP1mRNA表达均降低,三个时间段两两相比,差异均无统计学意义（P＞0.05）。3.ASODNs转染组免疫细胞化学结果:以5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L 3种不同浓度的两条反义寡核苷酸(ASODN_1-2)和1条无义寡核苷酸（N-ODN）转染食管癌EC-1细胞24h、48h、72h后,ASODN₁和ASODN₂两组中eIF4E、4EBP1蛋白表达与正常组相比均降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）;N-ODN组中eIF4E、4EBP1蛋白表达与正常组相比无明显降低,差异无统计学意义（P＞0.05）;ASODN₁和ASODN₂两组中eIF4E、4EBP1蛋白表达与N-ODN组相比均降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）;ASODN₁组中eIF4E、4EBP1蛋白表达与ASODN₂组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）;在ASODN₁和ASODN₂两组内,当时间相同时,eIF4E、4EBP1蛋白表达均随浓度的增加而降低,三种浓度两两相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）,当浓度相同时,eIF4E、4EBP1蛋白表达均随时间延长而降低,三个时间段两两相比,差异均无统计学意义（P＞0.05）;在N-ODN组内,eIF4E、4EBP1蛋白表达在各时间组和各浓度组进行比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。4.ASODNs转染组原位杂交结果:以5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L 3种不同浓度的两条反义寡核苷酸(ASODN_1-2)和1条无义寡核苷酸（N-ODN）转染食管癌EC-1细胞24h、48h、72h后,ASODN₁和ASODN₂两组中eIF4E、4EBP1 mRNA表达与正常组相比均降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）;N-ODN组中eIF4E、4EBP1mRNA表达与正常组相比无明显降低,差异无统计学意义（P＞0.05）;ASODN₁和ASODN₂两组中eIF4E、4EBP1 mRNA表达与N-ODN组相比均降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）;ASODN₁组中eIF4E、4EBP1 mRNA表达与ASODN₂组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）;在ASODN₁和ASODN₂两组内,当时间相同时,eIF4E、4EBP1mRNA表达均随浓度的增加而降低,三种浓度两两相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）,当浓度相同时,eIF4E、4EBP1 mRNA表达均随时间延长而降低,三个时间段两两相比,差异均无统计学意义（P＞0.05）;在N-ODN组内,eIF4E、4EBP1mRNA表达在各时间组和各浓度组进行比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。5.联合组免疫细胞化学结果:以60μg/ml浓度的榄香烯和15μmol/L的ASODN₁联合作用食管癌EC-1细胞24h、48h、72h后,联合组中eIF4E、4EBP1蛋白表达与60μg/ml浓度的榄香烯组相比有所降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;联合组中eIF4E、4EBP1蛋白表达与15μmol/L的ASODN₁组相比有所降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;联合组中eIF4E、4EBP1蛋白的表达随着作用时间的延长而降低,三个时间段两两相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）。6.联合组原位杂交结果:以60μg/ml浓度的榄香烯和15μmol/L的ASODN₁联合作用食管癌EC-1细胞24h、48h、72h后,联合组中eIF4E、4EBP1 mRNA表达与60μg/ml浓度的榄香烯组相比有所降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;联合组中eIF4E、4EBP1 mRNA表达与15μmol/L的ASODN₁组相比有所降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;联合组中eIF4E、4EBP1 mRNA的表达随着作用时间的延长而降低,三个时间段两两相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论1.榄香烯作用于人食管癌EC-1细胞后,eIF4E蛋白及mRNA的表达均降低,提示榄香烯可有效降低eIF4E基因的表达,从而发挥抗癌作用。2.不同浓度的eIF4E ASODN转染食管癌EC-1细胞后,食管癌EC-1细胞中eIF4E蛋白及mRNA表达均降低,提示eIF4E ASODN可有效抑制eIF4E的表达,从而对食管癌的治疗提供帮助。3.联合作用组中eIF4E蛋白及mRNA的表达均低于榄香烯组和eIF4E ASODN组,提示榄香烯和eIF4E ASODN联合应用后作用效果更显著。4.不同浓度的榄香烯和eIF4E ASODN作用于人食管癌EC-1细胞后,均可引起eIF4E基因表达降低,而与此同时4EBP1蛋白及mRNA的表达亦有一定程度的降低,提示在人食管癌中eIF4E可能对4EBP1的表达起某种调控作用。