【摘 要】
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目的:采用免疫组织化学的方法,分析BRAF突变与未突变型PTC患者原发癌灶中ILK蛋白的表达差异,探究ILK与恶性生物学行为相关的病理参数,协助临床早期筛选出转移风险高、预后差的高危PTC病种;通过培养离体BRAF突变的甲状腺乳头状癌细胞B-CPAP,采用多项分子技术以检测中药夏枯草干预B-CPAP细胞恶性生物学行为指标的变化,实验为了探究夏枯草作用于甲状腺癌的具体机制,以期为中医药防治甲状腺癌开
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目的:采用免疫组织化学的方法,分析BRAF突变与未突变型PTC患者原发癌灶中ILK蛋白的表达差异,探究ILK与恶性生物学行为相关的病理参数,协助临床早期筛选出转移风险高、预后差的高危PTC病种;通过培养离体BRAF突变的甲状腺乳头状癌细胞B-CPAP,采用多项分子技术以检测中药夏枯草干预B-CPAP细胞恶性生物学行为指标的变化,实验为了探究夏枯草作用于甲状腺癌的具体机制,以期为中医药防治甲状腺癌开辟崭新的道路。方法:1.第一部分组织病理实验:1.1收集2018年12月-2019年5月在河南中医药大学第二附属医院行甲状腺切除术,且术后由我院病理科明确诊断为甲状腺乳头状癌的46例患者的基本信息,统计所有入组患者BRAF基因突变和性别、年龄、原发灶直径、癌灶分布情况、彩超TI-RADS分级、癌症TNM及病理分期、原发灶是否侵及甲状腺外包膜与淋巴结、是否伴发自身免疫性甲状腺炎等病理参数之间的差异性。1.2对所有入组患者的原发癌灶切片后行免疫组织化学染色,以评估ILK蛋白的强弱。1.3根据前一步检测结果,记录46例组织ILK蛋白强弱的分级,分析ILK与PTC各项临床病理参数的相关性。1.4统计并分析ILK表达的强弱程度与PTC患者是否伴BRAF V600E基因突变的关系。2.第二部分细胞实验:2.1适宜条件下培养离体BRAF突变的甲状腺乳头状癌细胞B-CPAP,CCK8实验筛选出夏枯草抑制细胞增殖的最佳作用浓度。2.2以0.5-1.5mg/m L的夏枯草浓度作为后续实验作用范围,显微镜下观察药物作用后B-CPAP细胞形态的转化过程。2.3流式细胞技术检测夏枯草作用后B-CPAP细胞表面膜联蛋白染色程度,分析凋亡期细胞的比率。2.4在接种过细胞的六孔板底划几条平行的“-”形痕迹,分别测量药物浓度和作用时间的差异。2.5 Transwell小室上层内接种B-CPAP细胞,下层加入夏枯草溶液诱导细胞做趋化运动,观察并计数小室底膜透过的细胞数量。2.6 Western Blot实验从蛋白质水平验证适宜浓度夏枯草对B-CPAP细胞凋亡蛋白BAX、BCL-2、Caspase3和侵袭蛋白ILK的抑制作用,以及对MAPK通路蛋白ERK/p-ERK磷酸化水平的调控作用。结果:1.BRAF V600E基因突变与PTC多发癌灶、较高分期和分级、淋巴结和包膜外浸润呈正性相关（P<0.05）,与其他因素未见明显统计学关系,如性别、年龄、TI-RADS分级、原发灶直径、是否伴自身免疫性甲状腺炎等（P<0.05）。2.ILK蛋白在上皮乳头状组织中呈现强弱不等的阳性表达,强阳性信号与肿瘤较大直径、多灶浸润、淋巴结转移及包膜外侵等恶性生物学行为关系密切（P<0.05）。3.BRAF突变型PTC患者原发癌灶中检出ILK蛋白强阳性率远远高于未突变患者组（P<0.05）。4.CCK8实验结果显示高浓度夏枯草可明显抑制B-CPAP细胞活性,药物IC50约为0.94mg/m L。5.倒置相差显微镜下观察到药物作用24h后B-CPAP细胞生长受限,细胞膜完整性遭到破坏,变圆变亮细胞数目增加。6.流式细胞仪分析出的结果与相差显微镜下表现相符,加入夏枯草溶液的剂量越高,凋亡区域内的细胞百分比也相应增高。7.划痕实验结果显示无药物干预组24h后划痕区域已重新长满细胞,而夏枯草组无细胞带明显,细胞趋化生长受限,夏枯草抑制BCPAP细胞迁移的强度随药量和作用时间增长而增加。8.Transwell实验结果显示药物浓度越高,透膜迁移的染色细胞数量越少,高浓度夏枯草能够完全抑制细胞的进程。9.Western Blot蛋白电泳发现,与空白组相比,夏枯草可下调B-CPAP细胞的抗凋亡蛋白Bcl-2和侵袭蛋白ILK的水平,反过来使促凋亡蛋白BAX和Caspase-3的水平上调,同时降低MAPK途径代表蛋白p-ERK/ERK的磷酸化程度,而。结论:1.BRAF突变型甲状腺乳头状癌具有侵袭性强、分级较高的特征,ILK在此型癌症中呈现强阳性表达,与肿瘤较大直径、多灶浸润、淋巴结转移及包膜外侵等恶性生物学行为相关。2.中药夏枯草拮抗甲状腺肿瘤主要由线粒体途径触发,削弱癌症侵袭性的机制可能是BRAF基因突变诱发MAPK通路激活,与ILK蛋白交联干扰下游信号的传递。
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