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细胞壁对植物生长发育、物质运输、机械支撑以及防卫反应等方面具有重要作用。细胞壁多糖是生物体内含量最丰富的碳水化合物,其巨大的可发酵潜能使之成为清洁能源的首要选择。因此对其的研究具有十分重要的理论和实践意义。植物细胞壁是由纤维素、半纤维素和果胶等多糖分子以及合成机理木质素等聚合而成的复杂网络结构,目前对其合成及沉积机制尚不十分明了。本文利用水稻脆秆突变体brittle culm10(bc10)对水稻细胞壁合成的分子机制进行了研究。
突变体bc10主要表现为茎秆机械强度下降,容易折断,另外还具有植株略矮、叶片淡黄等其他表型。细胞学研究表明bc10茎秆细胞的长度下降,从而导致植株高度的降低。扫描电镜和透射电镜结果显示,突变体厚壁组织的次生细胞壁显著变薄,说明该基因突变影响了细胞壁的正常合成。通过对细胞壁化学成分进行定量分析,发现突变体细胞壁中的纤维素含量严重降低,同时伴随木质素含量的代偿性上升。我们将细胞壁多糖进行充分水解后对其各种单糖组分进行了定量测定,发现突变体细胞壁中葡萄糖含量显著降低,而木糖、甘露糖、鼠李糖、岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖等均有不同程度升高,暗示突变体细胞壁结构的改变以及细胞壁合成中的复杂调控过程。
遗传分析表明,bc10突变表型由单一隐性基因控制。通过图位克隆方法对BC10基因进行了定位,进一步通过野生型和突变体的序列比对发现突变体中BC10基因发生了17bp的缺失,该基因的功能通过互补试验得到验证。基因组学分析表明水稻基因组中共含有15个BC10类似基因,它们都编码未知功能的DUF266结构域。这些基因在转录水平均有表达,并且具有不完全相同的表达模式。BC10基因在水稻生长发育的各个时期和部位均有表达,尤其在茎秆中表达量最高。RNA原位杂交结果显示,BC10主要在厚壁组织及维管束中表达。
结构分析表明BC10蛋白的氮末端具有40个氨基酸的跨膜结构,我们将BC10-GFP转基因植株的提取物进行分级,发现BC10蛋白存在于内膜系统内。将内膜组分利用高盐、强碱和表面活性剂处理证明BC10以镶嵌的方式存在于内膜系统中。进一步的研究表明,存在于内膜系统中BC10-GFP蛋白只有在表面活性剂存在的条件下才能被蛋白酶K降解,说明该蛋白以N末端朝向胞浆中。利用BC10-GFP与各种细胞器标志基因在烟草BY-2细胞中共表达,证明BC10蛋白定位于高尔基体中。
通过结构域比对发现DUF266结构域与人类糖基转移酶C2GnT具有较低的相似性,在CHO细胞中表达的BC10仅表现出微弱的C2GnT活性。通过Westernblot和蛋白原位免疫荧光染色技术及生化测定对细胞壁中的糖表位进行检查,发现突变体中糖基化修饰的AGP含量下降,这种变化与BC10功能之间的关联还在进一步研究中。