细菌性阴道病(Bacterial Vaginosis, BV)是育龄期妇女最常见的阴道感染性疾病,是妇科门诊中有异常阴道分泌物患者最常见的病因,严重威胁着广大妇女的健康。细菌性阴道病与一些感染性疾病有关,是妊娠并发症的危险因素,是造成早产、胎膜早破、低体重儿早产、复发性流产、绒毛膜羊膜炎等的主要原因,并且BV增加包括HIV在内的性传播疾病的危险性。临床用甲硝哇和克林霉素按标准方法治疗,3月内复发率高达30%。细菌性阴道病的病因特别是病原学方面缺乏深入了解,目前认为细菌性阴道病是由微生物菌群失调所致,患者阴道内正常存在的乳酸杆菌Lactobacillus减少,而其它致病菌或病原微生物变为优势菌。生育期健康女性的阴道内有大量正常寄生菌,以乳酸杆菌为主包含Lactobacillus crispatus和Lactobacillus iners。乳酸菌分泌过氧化氢H2O2,从而维持阴道内的酸性环境,抑制阴道微生物的过度生长。研究显示患BV妇女阴道乳酸菌减少的同时,伴有厌氧和兼性细菌大量繁殖,仅乳酸菌减少还不能确定为患有细菌性阴道病。阴道加德纳菌属和动弯杆菌是之前报道的最常见BV菌属,但是这些菌属也被发现存在于BV阴性的个体中,并且单独一种细菌的存在不能作为该疾病的特异性标志物而确诊为BV。因此,要正确理解BV的病因和病理机制,必须对成人健康女性和BV患者阴道内的微生物种群进行全面的分析和比较。在过去的一个多世纪里,直接培养法一直被用来鉴定生态环境中的微生物种群多样性。由于环境中存在着很多不能培养和无法鉴别的细菌,复杂菌群的分析受传统培养技术和生化鉴定的限制,无法展示真实的菌群结构。随着PCR技术和测序技术的发展,我们可以更全面系统的研究复杂的微生态。核糖体小亚基16S rDNA基因序列是分子鉴定细菌中最常用的位点,16S rDNA存在于所有细菌染色体基因中,含有保守区域及可变区；保守区适于设计通用或特异性引物,同时可变区域因细菌不同而异,利用可变区序列的差异来分类鉴定菌种。因此可采用PCR扩增16S rRNA可变区序列片断,构建克隆文库测序。测序所得序列上传至大型16r DNA数据库中并做序列比对,鉴定样本中存在的微生物种类,分析标本中细菌的种类和起源,从而推测细菌的系统发生。尽管传统测序技术为菌群分析提供了一个框架,但由于测序克隆数量限制,无法全面真实的展现菌群多样性。新一代测序技术(Illumina高通量测序和Roche454技术)的成熟和普及,使我们能够对环境微生物进行深度测序,获得大量序列。新一代测序技术分析16SrRNA基因高变区的特征序列,在小规模平台上鉴定菌种。16S rDNA序列有9个可变区和10个保守区,其中V3(约60bp)和V6区(约70bp)可以分别用来鉴定大多数细菌。通过设计特异的PCR引物对阴道样本DNA提取物扩增,得到V3或V6区的序列,两端加上接头,利用高通量测序技术进行测序分析,以获得环境样品中细菌的物种分类、种群结构、群落比较等信息。中国南北方气候明显不同,人群生活习惯、个体免疫体质及环境微生物的状况也有很大差别。分析两地BV患者的阴道分泌物样本菌群,有助于了解不同环境区域BV患者菌群易感性的差异。一、中国北方哈尔滨细菌性阴道病与正常妇女阴道菌群的对比分析本研究选取中国北方哈尔滨市BV阳性和非BV妇女阴道分泌物样本各十例,利用16SrDNA全长基因扩增及构建克隆文库并挑选克隆测序的方法,研究阴道微生态的多样性。16SrDNA的PCR产物克隆入pMD19T载体构建克隆文库,通过X-gal蓝白斑方法筛选阳性克隆进行Sanger测序。序列数据信息处理,过滤低质量数据、剪接载体和引物序列,获得分析序列与16SrDNA数据库中的序列比对。在各分类级别层面上评价样本的菌群多样性和结构组成,计算分类物种的菌种丰度。多变量分析比较多个文库的菌群结构,统计比较阳性组和阴性组间的菌种分布差异,分析BV患者的菌群结构。按照97%序列相似度分类,BV组10例样本的的分类OTU数量29.4±9.3显著高于BV阴性组10例样本11.7±7.8(P<0.001)。Shannon、Simpson、Chaol值,ACE值,Good’s coverage, evenness多样性等指数比较,BV阳性组物种类目更丰富,物种分布更为均匀。加工整理后的克隆序列上传至RDP数据库Seqmatch比对,鉴定注释微生物菌种,BV阳性组比BV阴性组中发现的菌群更丰富且多样。基于菌门phylum级别分类,文库内所有序列分属6大门。厚壁菌门Firmicutes在两分组文库中的数量都是最多,BV阳性样本中放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes丰度较高。在属genus分类水平上,BV阳性组各样本分类所得genus数为11.8±4.44,显著多于BV阴性组各样本分类所得genus数3.9±3.35(P<0.001)。BV阴性样本的优势菌为乳酸菌属Lactobacillus,其分类下species物种内发现有L. iners, L. jensenii, L. crispatus, L. vaginalis和L. gasseri; L.iners占BV阴性克隆文库全部序列的丰度达83.73%,其次为L. crispatus占10.21%,显著多于BV阳性组。相对应的,BV阳性组样本含有更多元化的菌种分类。我们发现几种细菌与BV有强相关关系,包含Atopobium, Prevotella, Gemella, Sneathia, Peptoniphilus, Anaerococcus, Parvimonas, Dialiste,他们的丰度和检出率在组间都有显著差异。Gardnerella vaginalis在4例BV阳性样本和1例BV阴性样本中有发现,统计学比较丰度及检出率无显著差异。根据分类学结果,我们发现4个可能的新菌种属型,其中两个Ruminococcaceae科的uncultured bacterium与BV相关,另外未经确认的Coriobacteriaceae bacterium和Clostridiales bacterium低丰度出现,但未发现与BV显著相关性。应用非培养方法能够发现目前培养方法还未能分离鉴定的部分菌种。基于genus分类进行PCA主成分分析,Lactobacillus和Anaerococcus分散为两簇,对样本间分组有最主要贡献,按照菌种贡献作用对样本聚类,BV阴性样本聚为一簇,BV阳性样本中的9例菌属距离较近。我们的数据证实了BV阳性患者与非BV人群相比,BV患者阴道微生物的种类丰富度发生了的变化,菌群的分类学丰富程度和多样性显著增加。BV阴性样本的优势菌为乳酸菌属Lactobacillus, L. iners和L. crispatus是有保护作用的乳酸菌种。在不同种族的妇女身上发现的不同种属类型,宿主的遗传因素、阴道局部免疫在决定阴道微生物群落的成分中起非常重要的作用。有几种厌氧细菌与BV有密切的关系,包括Atopobium, Prevotella, Gemella, Sneathia, Peptoniphilus, Anaerococcus, Parvimonas, Dialiste,其中多种菌属对灭滴灵耐药,故BV治疗后易复发。G. vaginalis物种BV阴性样本中低丰度的存在,其不能作为疾病的特异标志物,针对G. vaginalis结合Atopobium、Prevotella的特异性PCR实验应用于BV诊断,有助于提高敏感性并针对性治疗。全面的调查阴道微生物生态系统的结构与丰富度,对于理解阴道疾病的病因以及预防治疗疾病是至关重要的。二、高通量测序比较中国南北方细菌性阴道病的菌群多样性为了达到更好的测序深度和文库覆盖度,获取菌群的完整信息,第二部分实验采用高通量深度测序16S rDNA高变V6区片段序列,检测中国南北方各10例BV阳性妇女阴道细菌。测序原始序列去除接头和低复杂度低质量序列,双向序列拼接装配成为V6Tag序列,进行物种分类、OTU分析、多样性分析、多样品的比较分析,分析阴道微生物群落结构是否随外界环境的改变而发生变化。利用Illumina测序V6高变区,20个样品共得到1,545,668条tags,约30%原始reads通过了所有质量控制,大部分tag序列的长度为75bp左右。去冗余处理20个样本挑选出单一的unique tag序列。预聚类后的tags在97%的相似度下做OTU分类。对20个样本的序列混合聚类,共分类得到829个OTU,两组共享168个OTU占20.26%。南方组各样本分类得80.2±32.8个OTU,北方组各样本分类得84.5±33.3个OTU,两组的OTU数量无显著差异(P=0.775)。基于OTU的结果计算样品Alpha多样性,大部分样本菌种丰富且均匀。个别的,南方样本中107和55号物种更为丰富,北方样本中19和135号物种相对较为单一。绘制稀释曲线,评价测序量并反映物种丰富程度,大部分样本趋于平缓或者达到平台期。高通量测序提供了大量的序列数,测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种。使用BLASTN将20个样品的unique tag序列比对到16S rDNA V6数据库中,挑选其中的最佳比对结果鉴定物种,物种注释中选择“科”的水平作为最佳的物种分类水平。按科分类丰度绘制热图heatmap,比较20个样本间相似度。基于菌门phylum级别分类,文库内所有序列分属10大门。南方样本中,放线菌门Actinobacteria在整个菌群中占有最大丰度,第二大丰度为厚壁菌门Firmicutes,其次为拟杆菌门Bacteroidetes。但各类群丰度分布在北方样本有所不同,厚壁菌门Firmicutes为最大丰度类群,其次为放线菌门Actinobacteria和拟杆菌门Bacteroidetes。南方组和北方组间各样本的门、纲、目、科类丰度组成无统计学差异(P>0.1)。之前发现的致病菌或BV相关菌种在各样本都有低丰度存在,Bifidobacteriaceae高丰度的样本中,同时伴随出现Prevotellaceae的高丰度存在。全部样本的tag中Lactobacillaceae分类中99.96%的序列被鉴定为L. iners属。从阴道菌群优势类群的分布及比例比较两地BV人群的差异,组间的显著差异的菌科有Micrococcacea, Pseudomonadalese, Burkholderiaceae, Lactobacillaceae。计算最佳分类水平的beta diversity,反映不同样品间在物种多样性方面存在的差异大小,北方52号样本和南方55号样本的多样性差异最小,而多样性差异最大为北方19和南方122样本。经主成分分析,对20个样品差异贡献作用较大的类群主要有Bifidobacteriaceae和Lactobacillaceae,其次为Lachnospiraceae和Prevotellaceae。利用多变量分析方法在预测两组之间的分类情况时,显现出乳酸菌优势的人群与其他菌种优势的人群存在分开趋势。采用Illumina高通量测序南方和北方BV患者的16SrDNA高变V6区,对数据进行处理,通过有效的信息分析过滤筛选,得到丰富的序列结果。OTU及Tags物种注释中选择“科”的水平作为最佳的物种分类水平,保证物种的等级与注释到的Tag数量两因素的平衡。两组样本中的优势菌种类较相似,主要有Bifidobacteriaceae, Prevotellaceae, Lachnospiracea, Lactobacillaceae, Leptotrichiaceae, Ruminococcaceae, Veillonellaceae,前四个菌科对样品差异贡献较大,与前期克隆文库方法鉴定的BV相关菌种大部分所属菌科相同。比较分析组间的差异因子为Micrococcacea, Pseudomonadalese, Burkholderiaceae, Lactobacillaceae,可能与不同外界环境或个体免疫因素相关。聚类分析样本区分的结果,验证了环境因素的影响相对较小。由于个体局部免疫反应的复杂性,还需要对相似阴道环境的样本进行更全面的调查。本课题采用现代分子生物学(非培养法)结合生物信息技术,深入研究阴道微生物种群的组成、结构、分布多样性及其动态变化,对比观察健康女性和BV患者,南方和北方BV患者阴道微生物种群之间的差异。采用16SrDNA序列信息分析技术,可以直接从临床标本中快速检测和鉴定不能培养的细菌,反应菌群的多样性。从而为细菌性阴道病的诊断、治疗、疗效考核、预防以及疫苗的研制提供理论依据,具有广阔的应用前景。