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鸡白痢沙门菌是当前危害我国养鸡业的重要病原菌之一,流行范围广,雏鸡的发病率和死亡率高,给养鸡业带来了较大的经济损失。《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》提出种禽场鸡白痢净化要求。疫苗接种是降低鸡群感染和防控鸡白痢沙门菌的有效手段,其中减毒活疫苗与其他疫苗相比,不仅具有诱导宿主产生持久免疫应答的特点,还可以通过基因敲除策略获得区分自然感染与疫苗免疫动物的（Differentiation of Infected and Vaccinated Animals,DIVA）特性,这对种群中鸡白痢的净化具有重要意义。本研究首先对2019-2020年度华东地区禽源临床病料开展了沙门菌流行病学调查并对分离沙门菌的耐药性展开评估,其次对具有DIVA特性的鸡白痢沙门菌S004ΔaroAΔsipBΔrfaG减毒疫苗候选株的免疫效力进行评价,为进一步研发安全高效的鸡白痢沙门菌减毒活疫苗奠定基础。1、2019-2020年度华东地区禽源沙门菌的分离鉴定、耐药性分析和鹌鹑源鸡白痢沙门菌致病性研究在2019年5月至2020年5月期间,采集华东地区禽源临床样品进行沙门菌的分离鉴定,采用多重PCR和玻板凝集试验确定血清型,利用药敏纸片法测定了分离株对21种常用抗生素的耐药性,并选取一株鹌鹑源鸡白痢沙门菌开展针对鹌鹑的致病性研究。结果成功分离到76株沙门菌,其中鸡白痢沙门菌35株（占46.05%）,鼠伤寒沙门菌40株（占52.63%）,波斯坦沙门菌1株（占1.32%）。动物分离来源显示,鸡源沙门菌36株（占47.37%）,以鸡白痢沙门菌感染为主,占比为86.11%（31/36）;鹅源沙门菌22株（占28.95%）、鸭源沙门菌11株（占14.47%）和鸽源沙门菌2株（占2.63%）,均以鼠伤寒沙门菌感染为主,占比分别为95.5%（21/22）、90%（9/10）和100%（2/2）;鹌鹑源分离株5株（占6.58%）,鸡白痢沙门菌占60%（3/5）和鼠伤寒沙门菌占40%（2/5）。药敏试验结果显示,分离株对青霉素、苯唑西林、红霉素和利福平等抗生素的耐药率均超过80%,尤其对苯唑西林的耐药率为100%,多重耐药率为77.63%,鼠伤寒沙门菌及鸡白痢沙门菌多重耐药率分别达87.5%和68.57%。鹌鹑源鸡白痢沙门菌致病性试验显示,其肝脏肿大呈土黄色、肺脏出血,气囊接种鹌鹑的半数致死量（LD50）为 9.5×105 CFU。2、基于沙门菌aroA和invA基因的双重荧光探针定量PCR检测方法的建立本研究建立了一种鉴别野生型菌株和缺失aroA基因的鸡白痢沙门菌疫苗株的核酸检测方法。分别设计针对invA基因和aroA基因的特异性荧光定量PCR引物和探针。结果显示,成功构建了分别针对invA基因和aroA基因标准品质粒,绘制了标准曲线;特异性结果显示,该方法可以同时扩增野生型菌株S004的aroA和invA基因,而针对鸡白痢沙门菌疫苗候选株S004ΔaroAΔsipB,仅能扩增invA基因;灵敏性试验结果表明,该方法对aroA基因和invA基因的检测灵敏度可达101 CFU/mL;S004ΔaroAΔsipB、Sm24和S004菌株在十二指肠黏膜、空肠黏膜和肝脏的载菌量检测结果显示,所建立的双重荧光定量PCR探针法与细菌平板计数法的检测结果趋势一致,并能区分aroA基因缺失株及野生株。上述结果表明,所建立的基于沙门菌aroA和invA基因的双重荧光探针定量PCR检测方法特异灵敏,同时具有可区分aroA基因缺失株和野生株的特性。3、减毒鸡白痢沙门菌缺失株S004ΔaroAΔsipBΔrfaG的免疫效力评价对2日龄SPF雏鸡口服接种减毒疫苗株S004ΔaroAΔsipBΔrfaG、野生株S004、商品化疫苗Sm24和PBS,体重监测显示,在21 d的免疫期内S004ΔaroAΔsipBΔrfaG免疫组体重与PBS健康对照组和sm24疫苗对照组体重相当（P>0.05）。运用所建立的双重荧光探针定量PCR检测方法对细菌体内分布情况进行测定,结果显示,接种后14 d,S004ΔaroAΔsipBΔrfaG和Sm24免疫组在肝脏和十二指肠黏膜组织未检测到invA基因,但S004在免疫后21 d仍能检测到invA基因,表明减毒疫苗株可以在早期实现体内清除,安全性高。同时,aroA基因和invA基因在S004和Sm24组均可以检测到,而S004ΔaroAΔsipBΔrfaG仅能检测到aroA基因,表明病原学鉴别检测策略成功。血清抗体水平检测结果显示,S004ΔaroAΔsipBΔrfaG免疫组血清中IgG水平在第3周与Sm24免疫组相当（P>0.05）,显著高于PBS对照组（P<0.05）。血清玻板凝集试验显示,免疫后7 d、14 d和21 d,S004ΔaroAΔsipBΔrfaG免疫组的血清无凝集反应,符合其DIVA特性。免疫后14 d用S004株对免疫组进行口服攻毒,结果显示,攻毒后5d,S004ΔaroAΔsipBΔrfaG组的体重与PBS健康对照组相当（P>0.05）,但Sm24组和PBS攻毒对照组体重显著低于PBS健康对照组（P<0.05）;攻毒后3 d和5 d,S004ΔaroAΔsipBΔrfaG免疫组的invA基因拷贝数与aroA基因相当（P>0.05）,表明在十二指肠和肝脏内仅为野生株S004,无S004ΔaroAΔsipBΔrfaG疫苗株;且攻毒5 d后,S004ΔaroAΔsipBΔrfaG免疫组的invA基因和aroA基因拷贝数均显著低于攻毒对照组（P<0.05）,表明疫苗株免疫后能够有效抑制野生株S004在十二指肠和肝脏内的定殖。综上所述,S004ΔaroAΔsipBΔrfaG株具有DIVA特性及良好的安全性和免疫效力,可以作为鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株。