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目的:1.利用IncuCyte ZOOM系统从培养成功的6株原代肿瘤细胞筛选单克隆细胞株。2.挑选两株单克隆细胞利用IncuCyte ZOOM进行克隆形成能力检测。3.挑选原代肿瘤细胞92N及其3株单克隆细胞并对其细胞的形态、细胞周期、生长、迁移与侵袭能力、干细胞标志物等生物学特性进行鉴定。方法:1.采用IncuCyte ZOOM系统的实时动态追踪和全孔成像技术对肿瘤细胞进行单克隆筛选及克隆形成能力分析。2.利用荧光倒置显微镜对单克隆细胞株的细胞形态进行观察,并采取HE染色利用IPP软件计算核质比。3.采用IncuCyteZOOM系统对单克隆细胞株生长、迁移与侵袭能力进行比较分析。4.采用荧光定量PCR技术对单克隆细胞株的细胞上清液中HBV DNA载量进行检测。5.采用免疫荧光方法对单克隆细胞株的AFP、CK18、CK19、GPC3、HepPar-1、PCNA、Vimentin蛋白表达情况进行检测。6.采用流式细胞术对单克隆细胞株的细胞周期及干细胞的表面标志物DLK-1、CD47、CD13、CD133、CD24、CD44、CD90、EpCAM表达情况进行检测。结果:从培养成功的6株原代肿瘤细胞(78T、83N、92N、216N、216T1、216T2)中成功筛选出89个持续增殖的单克隆,其中67个克隆扩增培养并冻存;并且通过时序图准确有效地排除了18个不能持续增殖的单克隆和28个由两个及以上细胞组成的多克隆。两例单克隆细胞株(216T1-SC-B11,216T2-SC-H11)克隆形成能力分析表明,14 d时平皿方法的克隆形成率(35.17%,13.17%)高于IncuCyte ZOOM 96孔全孔成像(23.13%,5.51%),且差异有统计学意义(P<0.05);延长至21 d时全孔成像的克隆形成率为(35.63%,13.22%),与平皿方法比较无统计学差异。来源于同一患者的3株单克隆细胞,其中92N-SC-C12、92N-SC-F4形态相似,92N-SC-B2形态与其他两株细胞形态存在差异。利用IncuCyteZOOM系统在相差模式下,以细胞融合度模式分析单克隆株的生长能力,单克隆株92N-SC-F4的倍增时间小于其他2株单克隆细胞,倍增时间(h)为35.00±5.00,且3株单克隆的倍增时间均小于原代肿瘤细胞92N(60.67±2.08);以伤口宽度的模式比较3株单克隆细胞的迁移侵袭能力,发现92N-SC-F4迁移侵袭能力强于其他2株。细胞周期分析发现92N-SC-F4的G2期比例大于其他两株单克隆,G1期比例小于其他两株单克隆。细胞上清液中HBV DNA载量检测,3株单克隆细胞及原代肿瘤细胞的HBV DNA均为阳性,其拷贝数>105;免疫荧光结果显示单克隆细胞株及原代肿瘤细胞92N均强表达CK18,蛋白HepPar-1均显示阴性;3株单克隆细胞均不表达AFP;对蛋白Vimentin、GPC3、PCNA弱表达;对CK19的表达存在差异。实验发现蛋白Vimentin、GPC3、CK18在4株细胞的胞浆表达,PCNA蛋白在细胞核表达。肝癌单克隆细胞株对干细胞标志物分析结果显示,单克隆细胞株与92N细胞均高表达CD13与CD47,其表达比例超过99%;对DLK-1、CD24、CD90低表达或不表达;对CD44的表达单克隆株的表达比例(>82%)高于原代肿瘤细胞株92N(76.7%);对CD133的表达具有差异性,单克隆株92N-SC-F4表达比例(41.5%)远高于其他3株细胞;EpCAM在单克隆株92N-SC-B2、92N-SC-F4表达比例(>91%)远高于单克隆株92N-SC-C12(49.90%)。4株细胞多阳表达均为CD47/CD13/EpCAM/CD44/CD133,其表达比例由高到低依次为92N-SC-F4(33.2%)>92N-SC-B2(26.7%)>92N(15.6%)>92N-SC-C12(6.4%)。结论:实时动态活细胞成像系统(IncuCyte ZOOM)能够简便、准确、省时省力地实现单克隆细胞筛选和克隆形成率检测;对来源于同一个体的单克隆细胞的多种生物学特性鉴定,显示单克隆细胞间存在异质性;单克隆细胞对干细胞标志物的表达存在着差异,也反映出筛选的单克隆细胞株具有肿瘤干细胞特性。