生殖发育毒性评价在药物安全性评价中占有重要的地位,由于生殖毒性评价中人工操作比例较高,可能会存在测定方法未能标准化、检测结果干扰因素多、主观影响较大、结果判定误差较大等问题,随着我国药物非临床研究质量管理规范（GLP）的飞速发展和国内外实验室里硬件设施改善、软件开发进展迅猛,越来越多的自动化仪器应用到生殖发育毒性评价研究当中。例如用于检测雄性生育力的全自动精子分析仪;评价子代动物行为学的自主活动监测仪;评价F1代动物学习记忆能力的穿梭箱（shuttle box）及水迷宫等。使用这些仪器获得的数据客观、操作较人工操作简便。为了提高药物安全性评价研究质量,确保评价实验数据、结果、结论和报告的可靠性和可信性,必须使这些仪器设备处于受控状态,尤其是那些具有复杂功能、且用户可自行设置参数的、用于数据产生、测量、评估、处理和储存的仪器设备,应当定期或者在使用前对其进行全面鉴定（qualification）。本研究对在本中心实验室条件下的三台生殖毒性实验用仪器设备TOX IVOS精子分析仪、穿梭箱（Shuttle box）以及自主活动检测系统进行了仪器安装及操作鉴定,确认其是否满足实验要求及获得可靠的数据;同时通过自行设计的研究方法对仪器性能进行鉴定,评价仪器性能是否稳定,是否能够应用到GLP体制下的生殖毒性评价研究中;仪器鉴定过程中还对学习记忆能力评价用的方法进行了方法学验证以保证上述仪器能够在生殖毒性研究中提供可靠的数据。最后使用鉴定合格的仪器设备对一个中药单体NCS-010进行了生殖发育毒性安全性评价。第一部分GLP体系下生殖毒性安全性评价研究相关仪器鉴定研究一,TOX IVOS精子分析仪:本实验对TOX IVOS精子分析仪进行安装、操作及性能鉴定。以确保仪器能够正常运行,并产生可信的实验数据。安装鉴定:通过核对仪器运输清单、检测实验室的环境,来鉴定仪器是否能正常安装、工作环境是否能够满足仪器运行的需要。操作鉴定:通过讲解仪器相关硬件、培训相关软件、核对培训清单,以保证操作人员能够正常地运行仪器。性能鉴定:分别采用标准样品及大鼠精子进行检测,以鉴定TOX IVOS性能是否正常。标准样品检测实验分别取35 mol/mL、18 mol/mL两种浓度的标准物质accu-beads做两组实验,每种浓度取样两次,测定其浓度,并计算其均值,与标准值进行比较,以鉴定仪器基本的计数是否准确;采用10只成年雄性大鼠,取附睾精子,对大鼠精子进行浓度及动力学检测,通过比对人工计数与机器读数、速率的人工计算与仪器计算,以鉴定仪器对于精子计数及相关速率计算的准确性。另外,在对样本进行低温处理后,与未经低温处理的样本进行比较,鉴定仪器是否具有检测能力。鉴定结果:仪器的安装条件符合仪器的安装标准。仪器的工程师对仪器的相关硬件进行了介绍,并对使用该仪器设备的实验人员开展了仪器的相关软件包括 rat motality、animal motality、rat matrix 及 oval matrix 的培训。标尺长度为10μm,仪器测量准确。能够记录所进行的操作的相关记录。在35 mol/mL±5及18 mol/L±2.5范围内,分别对样品测定三次,所测标准品浓度均在标准浓度范围内。表明,仪器的计数功能准确。10只雄性大鼠的精子总浓度、运动精子浓度、总精子计数、运动精子计数的误差范围分别为0.23～0.49%、0.19～0.74%、1.75～6.67%、0.00～4.00%,误差范围均在可接受范围内。根据运动轨迹人工计算的直线速率VSL、轨迹速率VCL、平均速率VAP、头部摇摆频率ALH与鞭打频率BCF数值与仪器计算的数值相同,误差均为0%。表明,仪器对于精子运动速率的相关参数计算是准确的。与低温处理前比较,低温处理后精子的运动率显著降低,约降低29.9%。表明,该仪器对于影响精子运动的因素具有检测能力。研究二,对穿梭箱（Shuttle box）进行3Q鉴定（安装鉴定、操作鉴定、性能鉴定）,确保系统可以用来进行动物主动/被动回避反应实验。在Microsoft Windows XP操作系统下完成系统的安装,确保系统正确安装。确认该系统或设备处于正常运行状态,并记录相关信息和数据,证明设备和系统能达到所预期的各项功能。采用训练7天的4只SD大鼠进行性能鉴定研究,确保仪器整体性能处于正常状态。本次试验鉴定的Shutt Box系统包括4个穿梭箱,采用仪器分别记录动物在4个穿梭箱内遭受电击的次数,并同时分别人为观测记录动物4个穿梭箱中遭受电击的次数,研究发现4个穿梭箱仪器记录遭受电击次数的值与人为记录的基本一致,证明鉴定结果合格。学习记忆模型鉴定结果表明3只大鼠通过shuttle Box 6天训练,第7天可以主动回避电击。1只大鼠训练7天过程均不能回避电击,表明该方法能够评价动物的学习记忆能力。采用1只已学会躲避的动物分别在4个穿梭箱中完成测试,躲避次数差异在20%内,表明4台穿梭箱间没有差异,仪器检测结果可用于围产期实验的学习记忆能力检测。研究三,对自主活动监测仪进行操作及性能鉴定,选用5只动物在每个时间点均分成1轮测定,每轮1只,依次对8个检测探头进行测定。去除饲料和水瓶,每盒一只,置于待测位置,环境适应5分钟,然后记录各只小鼠在5 min内的自发活动次数,全部实验依次类推进行共8轮。结果表明,“Activity Monitoring System”软件可完成所有用户需求的操作,其中7个探头工作良好可以用于评价动物自发活动的实验中,但编号为“8”的探头所收集到的数据存在一定问题,建议不使用并即时送修。通过上述三个研究,得出小结:TOX IVOS精子分析仪、穿梭箱（Shuttle box）,在本实验室现有条件下,能够正常运行,并产生可信的实验数据。自主活动检测系统8个探头中有7个配合“Activity Monitoring System”软件可完成自主活动测定,并能得到可靠的数据,可应用于试验中。第二部分NCS-010临床前生殖毒理学安全性评价研究NCS-010是从传统中药中筛选出的一种小分子化合物,为我国自主研发的创新药。实验表明,该化合物在动物模型中表现出良好的抗抑郁作用,而且具有毒性低、药效快等特点,其作用机制可能完全区别于现有的单胺类抗抑郁药物。以下所述研究为在GLP实验室中开展的上述化合物的生殖毒理学安全性评价研究,共分3个专题:实验一灌胃给予NCS-010对Sprague-Dawley大鼠胚胎/胎儿发育的影响,选取交配成功大鼠80只,随机分为4组,每组20只,于妊娠第6日开始至妊娠第17日经口灌胃给予 NCS-010 Omg/kg、60mg/kg、250mg/kg、1000mg/kg,每天 1 次,于妊娠第20天解剖,检测指标包括:母体动物的临床症状、体重变化、摄食量、母体动物的黄体数、着床数,胚胎生存死亡情况,生存胎仔的体重、性别、外观、骨骼及内脏检查等指标,实验结果未观察到与NCS-010有关的SD大鼠胚胎/胎儿发育的指标改变。实验二经口灌胃NCS-010对Sprague-Dawley大鼠生育力及早期胚胎发育的影响,使用160只大鼠,分别为Omg/kg组、30mg/kg组、150mg/kg组、750mg/kg组,每组雌雄各20只,母鼠于交配前两周连续给予供试品至妊娠第七日,雄鼠于交配前4周开始连续经口灌胃给予供试品NCS-010,观察其对SD大鼠生育力及早期胚胎发育的影响,观察动物的临床症状,测定体重、摄食量、生育力情况（性周期个数、平均性周期天数、交配前天数、交配率、雌动物受孕率、受精率、精子运动率、精子总数与精子畸形率）、脏器重量（睾丸、附睾、前列腺、精囊腺、卵巢）及早期胚胎发育（黄体数、着床数、活胎数、着床痕数、死胎数、着床率、活胎率、死胎率、着床前丢失率及着床后丢失率）等指标,通过实验确认亲代动物的最大无毒剂量及胚胎无毒反应剂量均为 750mg/kg。实验三经口灌胃NCS-010对Sprague-Dawley大鼠围产期毒性的研究,共使用87只孕鼠,分别为溶媒对照组（21只）、低剂量组（22只）、中剂量组（21只）、高剂量组（23只）,于妊娠第15日开始至哺乳期结束经口灌胃给予溶媒及NCS-010供试品Omg/kg、60mg/kg、250mg/kg、1000mg/kg,评估包括母动物的体重变化、摄食量、临床症状、分娩状况、母动物的着床数,出生儿（F1代）生存情况、生存幼仔体重、性别、外观、身体发育、感官功能、运动能力、性成熟、生育力以及行为和记忆等指标,研究结果显示未见与供试品NCS-010相关的对SD大鼠出生前和出生后发育的影响。结论:本研究中于妊娠第15天至至哺乳期结束经口灌胃给予NCS-010,未见母体毒性及新生儿发育毒性;母体动物和新生儿发育的最大无毒性反应剂量（NOAEL）均为1000mg/kg。