葡萄是全球性重要果树之一,是世界上加工深度最高、加工产品最丰富的浆果类水果。色泽是葡萄浆果外观品质的重要组成部分,它不仅决定鲜食葡萄的市场价值,而且影响其加工用途与加工品的质量。决定葡萄果皮外观颜色的色素主要是花色苷,各种花色苷在果皮中的比例以及累积水平的不同使得葡萄果皮呈现出红色、紫色或黑色。MYB转录因子是参与花色苷生物合成最为广泛也是最为关键的转录因子之一。已有研究表明,葡萄果实着色与否主要决定于2号染色体上2个紧密连锁的MyB基因位点的基因型。目前,关于葡萄MYBA1和MYBA2基因位点的基因型及其单倍型组成与葡萄果皮色泽之间的关系、MABA41和MYBA2基因位点的等位基因如何参与调控葡萄果实着色性状形成、以及如何高效利用MYB基因位点的基因型和单倍型组成信息进行果实色泽性状的分子设计育种等诸多方面尚缺乏系统深入研究。本文通过特异性引物序列鉴定了大量葡萄种质中MYBA1和MYBA2基因位点的基因型及其单倍型组成,对单倍型组成不同的葡萄品种中的MYB调节基因及其着色相关结构基因的表达模式进行分析,同时对葡萄MYB调节基因VvmybA2r和VvmybA2w以及结构基因VvPAL-like的功能进行深入研究,为更好地解析葡萄果实着色的分子机理奠定了重要基础。在对213份葡萄种质果实色泽性状调查的基础上,通过特异性引物序列鉴定了其MYBA1和MYBA2基因位点的基因型及其单倍型组成,结果表明,99.1%葡萄种质的基因型和单倍型组成与其果实着色情况相吻合。同时,对鉴定出存在‘相引相’或‘相斥相’的‘奥拉皇后’和‘园瑞黑’葡萄,通过构建自交群体分析其后代群体的单倍型及其分离情况,判断出‘奥拉皇后’和‘园瑞黑’葡萄单倍型组成均为AC-N。通过分析A4YBA1和MYBA2基因位点的单倍型组成与果皮色泽的关系表明,单倍型构成中出现HapB或HapC-Rs的葡萄果皮颜色多为鲜红色或紫红色,而含有HapE2或HapC-N的葡萄果皮颜色多趋于黑色。此外,含有功能基因的单倍型数量越多,果皮的颜色越深,越接近紫黑色或黑色。对欧亚种与欧美杂种两大种群的基因型和单倍型分析发现,欧亚种(Vitis vinifera)与欧美杂种(Hybrids of Vitis vinifera and Vitis Labrusca)着色葡萄具有的单倍型组成类型有所不同,欧亚种着色葡萄品种中数量最多的单倍型组成类型是AC-Rs,而欧美杂种着色葡萄品种中数量较多的单倍型组成类型是AE1和AE1E2。为了验证“基于葡萄MYB基因型与单倍型调控果实着色的特点,预测不同亲本组合的后代群体着色类型以及分离比例的规律”的可行性,在未结果状态下鉴定‘玫瑰香、、ב克瑞森无核’、‘秋红宝‘><‘无核翠宝’杂交组合后代群体的单倍型,结果表明2个杂交组合后代群体的单倍型分离比均符合预期结果。此外,在果实成熟期对上述群体的果实着色情况进行调查,结果表明,上述杂交群体的果实着色情况与其MYBA1和MYBA2基因位点的基因型和单倍型鉴定结果完全吻合,这为葡萄果实色泽性状的分子设计育种奠定了基础。本文选择4种主要的单倍型组成类型(A、AC-Rs、AE2、AE1E2),从每种单倍型组成类型中随机选出2-4个果皮着色不同的葡萄品种作为试材,利用荧光定量RT-PCR分析4种单倍型组成类型的葡萄品种中花色苷合成途径中调节基因和结构基因在果实不同发育阶段的表达模式与果实色泽之间的关系。结果表明,PAL、4CL、CKS2、CHI1F3H1在不同单倍型葡萄品种中表现出相似表达变化趋势。F3’H在着色和非着色葡萄品种中都有表达,而F3’,5H在非着色品种不表达,在着色品种中表达,且F3.’,’H/F3、H影响果皮着色的深浅。在相同单倍型组成的着色葡萄品种中F3’H、F3’,5’H、UFGT、OMT、GST和Anmatho-te与果皮着色的深浅程度呈正相关。其中,在单倍型组成为AE1E2的‘巨峰’和‘巨玫瑰’葡萄中检测到VvmybA1、VlmybA1-3、V7mybA1-2和VlmybA2 的转录表达,且VvmybA1、VlmybA1-3 和 VtmybA2 的表达模式与UFGT和GST的相同,在幼果期至转色前期表达量均极低,在转色期快速上调表达,在转色至成熟过程持续处于高表达。VlmybA1-2在果实发育过程中表达量呈现先升高后降低的趋势,这与VvmybA1、VImybA1-3和VlmybA2表达模式不同,说明该转录因子在转色前期已经启动调控作用。上述研究结果将有助于进一步认识MYBA1和MYBA2基因位点MYB调节基因和花色苷合成相关结构基因的功能。基于NCBI中VvmybA2r和VvmybA2w已知基因序列,克隆出VvmybA2r和VvmybA2w的cDNA全长序列。氨基酸序列分析发现,VvmybA2r和VvmybA2w的N端有MYB转录因子高度保守的R2R3结构域,在R3结构域中包含一个能与bHLH转录因子相互作用的bHLH motif,说明它们可能和葡萄中的某个bHLH转录因子相互作用。qRT-PCR分析表明:VvmybA2r在果实着色进程中的表达模式与果实的着色过程密切相关,UFGT和LDOX的表达趋势与VvmybA2r的表达趋势相似。亚细胞定位结果表明:VvmybA2r和VvmybA2w均定位在细胞核中。转录激活特性结合生物信息学分析表明:VvmybA2ir有明显的转录激活活性,而VvmybA2w转录激活活性丧失,是由于其下游SNP位点(CA缺失)的存在导致C端的转录激活区受到影响。酵母双杂交和BiFC均表明:UBE2A和SAP5是VvmybA2w的互作蛋白。VvmybA2w可能参与SAP5和UBE2A介导的泛素化途径中,通过调节蛋白质降解途径,在葡萄果实抗逆过程中发挥重要功能。酵母双杂交试验表明:VvmybA2r、VvMYCA1和VvWDR1间存在互作关系。烟草瞬时表达分析表明:VvmybA2w不能促进花色苷合成,VvWDR1可增强VvmybA2r调控花色苷生物合成的效应。上述结果说明VvmybA2i与VvWDR1和VvMYCA1形成MBW复合体参与调控花色苷的生物合成。以‘夏黑’葡萄DNA为模板,从中分离出了2000 bp的VvPAL-like基因启动子序列,命名为pVvPAL-like。序列分析发现,在VvPAL-like的启动子序列中存在若干个激素和胁迫相关的顺式作用元件,表明其可能受生长素、ABA、乙烯、MeJA、水杨酸、光等诸多因素的调控。为更好地认识葡萄VvPAL-like的表达和调控机制,将在VvPAL-like启动子控制下的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)报告基因组成的嵌合表达单位通过根癌土壤农杆菌转化烟草。组织化学染色发现,在3日龄的转基因烟草幼苗的子叶、下胚轴以及根中均表现出强烈的GUS活性。此外,转基因烟草根、茎、果以及叶片的组织化学定位表明,40日龄的转基因烟草维管组织的木质部、叶脉、子房以及根中均能检测到较强的GUS活性。转基因烟草非生物胁迫试验表明,VvPAL-like启动子能被Cu、ABA、IAA、NAA、IBA、2,4-D、MeJA、ETH以及干旱诱导。启动子的5’删除试验表明,Vv AL-like启动子中存在3个正向调控区域(-2000到-1461 bp、-1461到-930 bp、-930到-424bp)和1个反向调控区域(-424到-292 bp);乙烯响应元件位于-1461至-930bp,MeJA响应元件位于-424至-292bp。因此,这些发现将有助于我们更好地了解VvPAL-like表达模式以及调控机制,同时也对其参与黄酮类生物合成途径和激素胁迫相应的分子机制有更进一步地认识。