论文部分内容阅读
背景与目的：肿瘤干细胞概念的提出至今已经有30年左右的时间。1997年Bonnet和Dick在对急性髓性白血病(AML)研究中发现,从AML患者体内分离获得的特定亚群肿瘤细胞种植到NOD/SCID小鼠后可以导致人类样白血病。之后,在多种实体肿瘤,如乳腺癌,脑肿瘤,肺癌,前列腺癌,黑色素瘤,卵巢癌,结肠癌,头颈部肿瘤,胰腺癌,肝癌,膀胱癌和皮肤癌中陆续分离出各自的肿瘤干细胞。肿瘤干细胞具有不断自我更新、抗凋亡和耐药等特性。近年来的研究表明肿瘤干细胞不仅在肿瘤的起始和生长中起重要作用,肿瘤干细胞在肿瘤转移中的也具有重要的作用。目前的研究提示EMT对肿瘤细胞的干性调控起着非常重要的作用,两者在信号通路上存在着交互现象。研究发现肿瘤干细胞的形成受到多层次基因的调节,其中microRNA表达异常与肿瘤细胞EMT及肿瘤干细胞的形成密切相关。前期研究提示miR-612通过抑制EMT过程从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和转移。所以本研究旨在前期工作的基础上进一步观察miR-612对肝癌细胞的干性是否具有调节作用以及其对肝癌侵袭前沿的调节作用,最后探讨miR-612参与调节肝癌细胞干性的可能作用机制。方法：本实验以肝癌细胞系MHCCLM3(相对低miR-612)和HepG2(相对高miR-612)为研究对象。首先采用瞬时转染miRIDINA mimic和hairpin inhibitor的方法实现miR-612在MHCCLM3中的过表达(miR-612-O)以及在HepG2中的封闭表达(miR-612-i),将上述处理的细胞进行肿瘤球和软琼脂克隆培养；采用慢病毒感染肿瘤细胞的方法实现miR-612在MHCCLM3和HepG2中的稳定过表达(miR-612-O)以及稳定敲低表达(miR-612-i),将上述处理的细胞进行体外细胞毒实验以及注射到NOD/SCID小鼠皮下进行成瘤性分析；将miR-612稳定过表达的MHCCLM3或HepG2(带绿色荧光)和miR-612稳定敲低表达的同种细胞等细胞数混匀打在裸鼠皮下以观察miR-612在肝癌侵袭前沿中的作用。最后通过Western blot、Real-time PCR、免疫细胞荧光及Luciferase reporter assays等方法探讨miR-612对Wnt/β-catenin信号通路的调节作用。结果：1)MiR-612 mimic瞬时转染能够显著抑制HCCLM3细胞的悬浮肿瘤球形成能力和软琼脂克隆形成能力；而miR-612 hairpin inhibitor封闭能够增强HepG2细胞的悬浮肿瘤球形成能力和软琼脂克隆形成能力。2)miR-612稳定上调的HCCLM3细胞在体外细胞毒实验中体现出对化疗药物(顺铂、氟尿嘧啶)的敏感性增加,同时其在NOD/SCID小鼠皮下成瘤能力下降；而miR—612稳定下调的HepG2细胞显示出对化疗药物更高的抵抗性,同时其在NOD/SCID小鼠皮下成瘤能力增强。3)将稳定过表达miR-612的HCCLM3(带绿色荧光)和被稳定敲低miR-612的HCCLM3(带红色荧光)细胞等量混匀注入裸鼠皮下,4周后将瘤体取出并制作成冰灯切片,荧光显微镜下发现移植瘤周边侵袭前沿组织主要由miR-612敲低表达的HCCLM3细胞构成。用同样的方法处理HepG2细胞得到相同的结果。4)鉴于前期研究的结果(miR-612通过抑制EMT过程从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和转移)以及E-cad和β-catenin之间的关系,我们选择wnt/β-catenin作为miR-612调节肝癌细胞干性的可能靶基因。Western blot结果显示miR-612并不能影响细胞内总的β-catenin水平；进一步免疫细胞荧光实验显示miR-612能减少胞质中的β-catenin向核内转移；TOPflash荧光素酶实验显示miR-612能降低细胞内TCF/LEF活性；Real-time PCR和Western blot结果显示miR-612能降低细胞内cyclin-D1和c-Myc表达量。悬浮肿瘤球实验显示miR-612可以逆转wnt信号通路激动剂wnt3α和BIO对悬浮肿瘤球形成的促进作用。结论：本研究揭示miR-612可以抑制肝癌细胞的悬浮肿瘤球及软琼脂克隆形成能力；增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性；抑制肝癌细胞在NOD/SCID小鼠皮下成瘤能力；重新调节肝癌细胞在侵袭前沿的分布,即再次证明其可抑制肝癌细胞的侵袭。而wnt/β-catenin在miR-612调节上述过程的通路中起重要作用。这提示miR-612有望成为临床肝癌有效的干预分子靶点。