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中华鳖(Pelodiscus sinensis)隶属于爬行纲、龟鳖目、鳖科、鳖属,是我国水产养殖的名特优品种。中华鳖拥有Z/W性染色体,属基因型性别决定(genetic sex determination,GSD)。在养殖过程中,雄鳖个体具有明显的性状和经济优势(生长速度快,个体大,裙边宽厚,营养价值丰富,市场单价高),因此性别控制和全雄苗种培育将是中华鳖养殖业的一个重要发展方向。实现这一目标的关键是解析其性别决定和分化的分子机制。R-spondin1(RSPO1)基因是R-spondins家族成员之一,编码一种含有1型血小板反应蛋白重复序列(TSR-1)的蛋白质。被认为是脊椎动物卵巢发育的一个调控因子。相关研究表明,RSPO1基因突变导致雌性向雄性性逆转,被认为是哺乳动物、鱼类卵巢发育的一个重要调控因子,但其在爬行动物性别决定中的调控作用还不清楚。本研究对中华鳖RSPO1基因进行了cDNA全长克隆,分析其表达规律,通过体内RNA干扰进行了功能缺失鉴定。结果如下:(1)RSPO1全序列克隆及进化分析通过RACE技术,我们克隆获得中华鳖RSPO1基因全长1975 bp,包括33bp 5′非编码区、738bp开放阅读框,1204 bp 3′非编码区、,编码245个氨基酸。同源性分析表明,中华鳖RSPO1基因的氨基酸序列与红耳龟的相似性高达94%。进化树分析显示,鱼类单为一支,鸟类、两栖类、爬行类和哺乳类聚为一支。其中,中华鳖RSPO1与红耳龟的亲缘关系最近,与青鳉鱼的亲缘关系最远,分支和物种的进化关系一致。(2)RSPO1的表达规律及在性逆转中的表达变化qRT-PCR显示,成年中华鳖卵巢中RSPO1的表达水平最高,明显高于睾丸、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、肌肉和小肠等组织。在中华鳖胚胎发育第14期时(性腺分化前),RSPO1基因就已经在性腺组织中出现表达,雌性表达量明显高于雄性。在之后的性别决定时期(15-20期)RSPO1维持这种雌性高表达趋势。在芳香化酶抑制剂(15、16期处理)诱导的雌性向雄性性逆转过程中,ZW性腺中的RSPO1表达量在第17期时就已经显著下调,接近对照组ZZ性腺中的表达水平,这说明RSPO1基因参与中华鳖雌性分化的启动过程(3)RSPO1的功能缺失研究我们通过RNA干扰,对RSPO1基因进行了功能缺失验证。组织学观察结果显示,RSPO1敲低后部分ZW胚胎的形态和性腺结构都出现明显的雄性特征,皮质区虽未退化至类似雄性的单细胞层,但髓质区明显发育,其中可见雄性性索,此时性腺呈现以雄性性状为主的间性特征。同时qRT-PCR显示,RSPO1敲低后ZW性腺中,卵巢发育关键基因Foxl2表达显著下调,而雄性基因Dmrt1表达明显上调。免疫荧光染色进一步显示,RSPO1敲低后,ZW性腺髓质区的性索细胞中检测到大量雄性SOX9蛋白信号,而且髓质区性索结构内观察到生殖细胞的分布,尽管在皮质区仍存在少量的生殖细胞,但数量明显少于对照组ZW性腺皮质区生殖细胞的数量。以上数据证明,在中华鳖性腺分化前,敲低RSPO1能够一定程度上导致雌性向雄性性逆转。本文克隆获得了中华鳖RSPO1基因的cDNA全长序列,揭示了其在胚胎性腺发育中的表达规律(雌性高表达),发现了RSPO1缺失能够诱导部分性逆转的发生,从而表明了RSPO1参与中华鳖性别决定和分化过程,是卵巢发育的重要调控因子。本研究为中华鳖性别决定与分化的分子机理研究奠定了基础,并为雄性控制技术研发提供了理论依据。